2017, Vol. 31
2. 中国科学院兰州化学物理研究所 羰基合成与选择氧化国家重点实验室, 甘肃 兰州 730000
2. State Key Laboratory for Oxo Synthesis and Selective Oxidation, Lanzhou Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Lanzhou 730000, China
过氧化物酶(POD)可催化过氧化氢氧化有机化合物.天然POD可用于工业废水处理、医学临床分析、食品中微量酚的分析和酚类聚合物合成等许多领域.目前广泛应用的是辣根过氧化物酶, 大多数是从植物中分离提取得到的.天然辣根过氧化物酶价格昂贵, 并且容易失活, 由于其分子较大, 因此在酶联免疫分析的过程中, 使得抗原和抗体很难结合, 很难被标记.寻找一种模拟酶和催化体系来代替辣根过氧化物酶, 并探寻一种氧供体底物来提高模拟酶催化反应灵敏度是酶催化反应的研究热点.近年来, 金属配合物已成为化学模拟POD领域的研究热点.人工合成的POD模拟物通常以卟啉[1]、酞菁[2]或Schiff碱配合物[3-4]作为配体, 但由于天然酶复杂的结构性和POD催化氧化酚类物质反应机理的复杂性, 根据酶活性中心相似结构设计合成的模拟酶化合物通常存在活性低、专一性差、配合物溶解性差及污染环境等问题, 而H2O2由于具有价廉、易得、清洁、环保等优点, 因此发展以H2O2作氧化剂的过氧化物酶模型物的研究具有重要的理论价值和广阔的应用前景.
甲烷氧化菌是自然界中以甲烷为唯一碳源和能源生长的微生物, 通常含有活性中心为双核铁的可溶性甲烷单加氧酶(sMMO)和活性中心含有铜的颗粒性甲烷单加氧(pMMO)[5].铜在甲烷氧化菌中扮演着重要角色, 它不仅对甲烷氧化菌表达何种类型的甲烷单加氧酶(MMO)起到调控作用, 还参与了pMMO活性中心和内膜系统的构建[5-6].甲烷氧化菌素(Mb)是甲烷氧化菌向周围环境中释放的一种铜捕获小肽, 结合铜的Mb会被甲烷氧化菌重新识别吸收并将铜富集在细胞内供pMMO表达需要[7]. 2004年, Kim等[8]报道了Mb的结构数据, 分子量约为1 200的Mb由7个氨基酸和包含硫酰羟咪唑生色团的特殊部分组成, 通过2个咪唑N和2个硫酰S与铜配位. 2008年, Behling等[9]对Mb结构进行了修正, 将羟咪唑改为唑酮、异丙酯改为甲基丁酰基. Choi等[10]发现, Mb结合铜返回细胞后参与了pMMO催化甲烷氧化, 同时增加了流向pMMO中心Cu(Ⅱ)的电子量, 并且具有催化O2-. 为H2O2的超氧化物歧化酶(SOD)活性、烟酰胺嘌呤二核苷酸(NADH)依赖的过氧化氢还原酶活性和氧化酶活性, 表明Mb在pMMO催化甲烷氧化中起到催化电子由NADH等电子供体向pMMO传递的作用, 同时具有清除氧化反应中产生的氧自由基的细胞保护作用.
纳米金由于具有大的比表面积、高的表面自由能及具有吸附浓缩效应, 可增强酶在载体表面上的固定化.特别是以柠檬酸钠还原法制备的金溶胶, 因为吸附过量的柠檬酸根阴离子而带负电荷, 所以可通过静电吸附作用来固定酶分子.而且, Grabar等[11-12]研究发现纳米金与有机物分子中的硫原子和氮原子可以形成作用力较强的共价键, 这也为酶分子以纳米金为载体用Mb对其修饰提供了有效的途径, 采用铜离子配位甲烷氧化菌素功能化纳米金模拟POD可能从非天然酶角度获得新型高效模拟POD金属配合物结构信息, 设计合成出高效的POD模拟酶.
1 实验部分 1.1 试剂与仪器甲基弯菌IMV 3011(Methylosinus trichosporium IMV 3011)由俄罗斯科学院催化研究所提供; NMS培养基参照文献[13]方法配制; Diaion HP-20大孔树脂购于日本三菱化工公司; 甲醇, 氯金酸, 柠檬酸钠, 硫酸铜, NaH2PO4, Na2HPO4等均为分析纯.
日本岛津UV-2550型紫外-可见分光光度计; 日本日立F-7000FL220-240V型荧光光谱仪; 美国PerkinElmer 100傅立叶变换红外光谱仪; 美国Sigma公司Z-16K型高速冷冻离心机.
1.2 实验方法 1.2.1 Mb的制备参照文献[13]方法培养甲烷氧化菌.参照文献[9-10]方法, 将发酵液于4 ℃下以9 000 r/min转速离心, 取上清液, 采用动态吸附法使用活化的Diaion HP-20大孔径树脂(1.1 cm × 80 cm层析柱)进行吸附, 再用60%甲醇洗脱吸附的Mb, 得到的Mb于60 ℃旋转蒸发后, 经真空冷冻干燥得白色粉末状Mb.
1.2.2 纳米金-Mb-Cu的制备参照文献[14]方法制备纳米金, 取2 mL Mb溶液, 依次向其中加入适量纳米金和CuSO4溶液混合均匀, 即得到Mb、Cu2+修饰的金纳米粒子, 用紫外-可见吸收光谱监测金纳米粒子溶液的变化.
1.2.3 动力学检测在100 mL容量瓶中依次加入催化剂纳米金-Mb-Cu、过氧化氢和一定浓度的底物对苯二酚, 并用pH=7.0的缓冲溶液定容, 使溶液中纳米金-Mb-Cu的浓度为3×10-5 mol/L, 过氧化氢的初始浓度为5×10-3 mol/L, 对苯二酚的初始浓度为6×10-4 mol/L.密闭反应装置, 在恒温下搅拌, 每隔一定时间取出反应液, 用紫外-可见分光光度计监测反应物对苯二酚在λ= 288 nm处的吸光度随时间变化的过程.参考文献[15]方法, 将反应按准一级处理.采用与反应物和产物浓度成正比的吸光度(A)代替浓度c, 测定吸光度A的变化来监测反应进程, 由一级反应的速率方程ln (At-A∞)-ln (A0-A∞)=-Kobst按最小二乘法拟合得到表观速率常数Kobs.
2 结果与讨论 2.1 催化过氧化氢氧化对苯二酚的UV光谱分析采用UV光谱对纳米金-Mb-Cu催化过氧化氢氧化对苯二酚的反应进行分析, 结果如图 1所示, 随反应时间的增加, 对苯二酚在288 nm处的特征峰的吸光度逐渐下降, 而在246 nm处产生新的吸收峰, 并且其吸光度随时间的增加而增加, 据文献报道[1], 新物质为二氧化醌.因此, 可利用288 nm的吸光度变化来研究纳米金-Mb-Cu催化过氧化氢氧化对苯二酚的动力学.
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图 1 Au-Mb-Cu催化过氧化氢氧化对苯二酚的UV光谱分析 Figure 1 UV-Vis spectrophotometry of hydroquinone oxidation catalyzed by Au-Mb-Cu |
如图 2所示, 紫外可见光谱表明, 向Mb中加入纳米金后, 随着纳米金含量的增加, 394、340和282 nm处的吸光度值逐渐下降, 直至稳定; 再向组装体系中加入铜后, 随着铜含量的不断增加, 394、340 nm处的吸光度值继续下降, 而282 nm处的吸光度值逐渐上升, 最后分别趋于稳定, 说明Mb已经与纳米金和Cu进行组装.
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图 2 Mb结合纳米金的紫外光谱分析 Figure 2 UV Spectra of Mb combined with gold nanoparticles |
Mb是一种具有荧光活性的小分子肽, 据文献报道[16], Mb分子在282 nm激发波长下在310 nm处有特征发射峰; 在340 nm激发波长下在450 nm附近有特征发射峰; 在394 nm激发波长下在461、610和675 nm处有特征发射峰.如图 3所示, 添加Au(0)后, Mb在λex/λem=282/310 nm处发射峰明显下降, 在λex/λem=340/440 nm处发射峰几乎被淬灭, 在λex/λem=394/610 nm处发射峰也明显下降, 表明Mb与Au(0)结合.
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图 3 Mb结合纳米金的荧光光谱分析 Figure 3 Fluorescence spectra of Mb combined with gold nanoparticles |
Mb修饰金纳米粒子和Mb的红外光谱检测如图 4所示, 结果如下:对比Mb与偶联产物的红外光谱, Mb的谱图中可见3 430 cm-1处为O—H的伸缩振动. 1 676 cm-1为酰胺Ⅰ带. 539 cm-1处为—S—S—的伸缩振动. 1 022 cm-1处为C—S键的伸缩振动吸收峰, 加入纳米金后, 539 cm-1处的—S—S—的伸缩振动明显减弱, 酰胺Ⅰ带1 676 cm-1峰也明显减弱.表明Mb是通过二硫键与金纳米粒子偶联, 形成了硫与金的配位键.
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图 4 Mb结合纳米金的红外光谱分析 Figure 4 Infrared spectroscopy of Mb combined with gold nanoparticles |
Au-Mb-Cu中的结构类似于卟啉环的作用.添加H2O2会引起水溶液中Au-Mb-Cu的UV光谱发生变化, 这种变化可能是由于配合物的金属离子与H2O2分子结合形成超共轭体系所致, 表明有新物种Au-Mb-Cu*产生.因此可认为此反应体系是一种类似酶催化的反应体系.首先, Au-Mb-Cu在氧化剂H2O2作用下, 变成高氧化态的活性中间体Au-Mb-Cu*, 该中间体与底物S可逆结合形成四元中间复合物Au-Mb-Cu*-S, 并快速达到预平衡; 然后, 四元中间复合物分解生成产物P, Au-Mb-Cu*被还原为初始态Au-Mb-Cu, 这一步为催化反应的决速步骤.在此过程中, 由于中间体复合物Au-Mb-Cu*的形成, 使H2O2氧化对苯二酚的反应转化为分子内的电子转移反应, 从而降低了反应的活化能, 提高了反应速率.在H2O2的存在下, Au-Mb-Cu又继续生成活性的Au-Mb-Cu*催化反应.该动力学主要的特征是具有氧化性的活性催化剂与底物首先通过可逆反应形成中间体复合物Au-Mb-Cu*-S, 该中间体再通过决速步骤形成产物, 同时催化剂被还原成Au-Mb-Cu.底物S在水溶液中自发反应生成产物P.反应过程可用式(1)来表示:
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(1) |
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(2) |
式中, Ks为四元复合物的结合常数, Kn为决速步骤中由四元复合物生成产物的一级速率常数, K0′为底物在水溶液中自发反应的一级速率常数.根据文献[15], 反应的速率方程为:
| ${{\rm{K}}_{{\rm{obs}}}}{\left[ {\rm{S}} \right]_{\rm{t}}} = {{\rm{K}}_{\rm{n}}}[{\rm{Au}} - {\rm{Mb}} - {\rm{C}}{{\rm{u}}^*} - {\rm{S}}] + {{\rm{K}}_{\rm{0}}}^\prime \left[ {\rm{S}} \right]$ | (3) |
| ${{\rm{K}}_{\rm{s}}}{\rm{ = [Au}} - {\rm{Mb}} - {\rm{C}}{{\rm{u}}^*} - {\rm{S}}\left] / \right[{\rm{Au}} - {\rm{Mb}} - {\rm{C}}{{\rm{u}}^{\rm{*}}}{\rm{]}}\left[ {\rm{S}} \right]$ | (4) |
根据物料平衡可得:
| ${\left[ {\rm{S}} \right]_{\rm{t}}}{\rm{ = }}\left[ {\rm{S}} \right]{\rm{ + [Au}} - {\rm{Mb}} - {\rm{C}}{{\rm{u}}^{\rm{*}}} - {\rm{S]}}$ | (5) |
| ${{\rm{[Au}} - {\rm{Mb}} - {\rm{C}}{{\rm{u}}^{\rm{*}}}\left] {{\rm{ = }}} \right[{\rm{Au}} - {\rm{Mb}} - {\rm{C}}{{\rm{u}}^{\rm{*}}}{\rm{]}}_{\rm{t}}} - {\rm{[ Au}} - {\rm{Mb}} - {\rm{C}}{{\rm{u}}^{\rm{*}}} - {\rm{S]}}$ | (6) |
| ${{\rm{[Au}} - {\rm{Mb}} - {\rm{C}}{{\rm{u}}^{\rm{*}}}{\rm{]}}_{\rm{t}}}{\rm{ = }}{\left[ {{\rm{Au}} - {\rm{Mb}} - {\rm{Cu}}} \right]_{\rm{t}}}{\rm{}}$ | (7) |
式中, Kobs为反应的表观一级速率常数, [S]t和[Au-Mb-Cu]t分别为底物和Au-Mb-Cu的总浓度.联立(3)-(7), 可得:
| $1/({{\rm{K}}_{{\rm{obs}}}} - {{\rm{K}}_{\rm{0}}}^\prime {\rm{) = 1/(}}{{\rm{K}}_{\rm{n}}} - {{\rm{K}}_{\rm{0}}}^\prime {\rm{) + 1/(}}{{\rm{K}}_{\rm{n}}} - {{\rm{K}}_{\rm{0}}}^\prime {\rm{)}}{{\rm{K}}_{\rm{s}}}{\left[ {\rm{S}} \right]_{\rm{t}}}$ | (8) |
当Kobs和Kn远远大于K0′时, 式(8)可以简化为:
| $1/{{\rm{K}}_{{\rm{obs}}}}{\rm{ = 1/}}{{\rm{K}}_{\rm{n}}}{\rm{ + 1/}}{{\rm{K}}_{\rm{n}}}{{\rm{K}}_{\rm{s}}}{\left[ {\rm{S}} \right]_{\rm{t}}}$ | (9) |
以1/Kobs对1/[S]t作图, 可得一条直线, 由直线的斜率和截距即可分别求出Ks和Kn.
2.4 pH对反应速率的影响图 5表明不同pH值对Au-Mb-Cu催化活性的影响.由此可以看出, 在pH=6~8范围内, Kobs随pH增加先上升, 在pH=7时达到最大值, 然后开始逐渐下降.这一结果类似于pH对天然过氧化物酶活性的影响.因此, Au-Mb-Cu模拟酶催化反应体系的最适pH在7.0左右.
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图 5 pH对催化反应速率的影响 Figure 5 Effect of pH on catalytic reaction rate |
在表示机理的式(1)中, Au-Mb-Cu*-S→Au-Mb-Cu+P这步可能包含两个中间反应: Au-Mb-Cu*-S→Au-Mb-Cu-S-+H+(中间体复合物Au-Mb-Cu*-S的酸式电离)和Au-Mb-Cu*-S+OH-→Au-Mb-Cu*OH-+S(中间体复合物Au-Mb-Cu*-S中的对苯二酚被OH-取代), Au-Mb-Cu*-S-进一步反应形成产物P.在此过程中, 反应体系中H+和OH-浓度过大都不利于Au-Mb-Cu*-S-的形成, 因此反应产物也难于形成.
2.5 温度对反应速率的影响天然酶的催化活性受反应温度的影响, 不同结构的酶的最适温度不同. 图 6表示Au-Mb-Cu催化过氧化氢氧化对苯二酚的表观一级速率常数随温度的变化情况.温度对催化反应的影响符合生物催化剂的一般规律.在25~70 ℃范围内, 催化反应的Kobs随着反应体系温度的升高而升高, 在70 ℃达到最大值, 在此之后, 催化反应的Kobs随着反应体系温度的升高而降低.这是由于在达到催化反应的最适温度前, 升高温度可加速活性配合物和中间复合物形成, 从而提高反应速率, 但温度过高则活性配合物和中间复合物的结构可能发生变化, 因而降低催化速率.该反应体系的最适催化温度大约为70 ℃.文献报道天然过氧化物酶在水溶液中的最适温度一般为30~40 ℃左右, 这表明Au-Mb-Cu比天然酶更稳定, 在较高温度下活性配合物仍能保持较高的催化活性, 不会失活和变性.
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图 6 温度对催化反应速率的影响 Figure 6 Effect of temperature on catalytic reaction rate |
图 7反映了过氧化氢/催化剂摩尔比对表观一级速率常数Kobs的影响.从图中可以看出, 当过氧化氢/催化剂摩尔比从低于30时, 随着过氧化氢/催化剂摩尔比的量增加, 催化反应的表观一级速率常数Kobs大幅度增加, 到30左右时, Kobs达到最大.当摩尔比大于30后, Kobs基本不再随过氧化氢/催化剂摩尔比的增加而变化.这在一定程度上表明了Au-Mb-Cu催化过氧化氢氧化对苯二酚是按照前述的四元复合物模型:即Au-Mb-Cu在氧化剂过氧化氢作用下变成高氧化态活性中间体Au-Mb-Cu*为快速步骤, 但过氧化氢浓度过高可能阻碍中间体复合物的产生, 因此过氧化氢可能起抑制剂的作用[17].
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图 7 过氧化氢/催化剂摩尔比对催化反应速率的影响 Figure 7 Effect of hydrogen peroxide/catalyst ratio on catalytic reaction rate |
我们以甲烷氧化菌素参与甲烷单加氧酶催化反应中电子传递过程为依据, 通过Au-Mb-Cu催化过氧化氢氧化对苯二酚的反应, 表明其具有良好的过氧化物酶活性.纳米金-甲烷氧化菌素(Mb)-铜配合物催化氧化对苯二酚符合酶催化的动力学规律.反应体系温度、pH值、过氧化氢/催化剂摩尔比对配合物催化活性的影响符合生物催化剂条件影响的一般规律.
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