2017, Vol. 31
2. 中国科学院兰州化学物理研究所 羰基合成与选择氧化国家重点实验室, 甘肃 兰州 730000
2. State Key Laboratory for Oxo Synthesis and Selective Oxidation, Lanzhou Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Lanzhou 730000, China
为了捕捉充足的Cu(Ⅱ), 甲烷氧化菌(如Methylosinus trichosporium OB3b, Methylococcus capsulatus)会释放出一种小分子荧光肽—甲烷氧化菌素(Methanobactin, Mb). Mb分泌到细胞外后, 将细胞外的Cu(Ⅱ)捕获和运输到细胞内, 激活颗粒性甲烷单加氧酶(pMMO)表达活性.进而pMMO作为氧化还原过程的关键酶, 催化在甲烷氧化菌细胞内CH4的氧化.同时在以往的研究中, 我们还发现Mb或Mb-Cu复合物具有较好的还原性[1-3]. Mb不仅可以与Cu(Ⅱ)结合, 同时也具有螯合Au(Ⅲ)并将其还原成Au(0)的能力.目前, 已采用生物法制备出修饰有Mb的单分散纳米金Mb-AuNPs, 该纳米金不仅性质稳定, 同时还保持有Mb的生物活性[1, 4-6].
一般来说, 蛋白质的尺寸大小在纳米级, 与纳米材料有较好的适应性, 更易使其打开活性中心.一方面, 纳米粒子具有较高的比表面积, 促使微型生物传感器表面的生物分子固定量呈指数倍增长, 有效扩大了电极表面电信号; 另一方面, 由于其尺寸效应造成的表面原子配位不足、亏电子严重, 使得纳米粒子对生物大分子有很强的吸附能力, 能高效地固定生物大分子, 在设计和制备各种具有特定功能的化学传感器方面具有重要意义[7].近些年, 借助纳米金制备具有氧化还原性能的生物传感器已多有报道[8-13].
我们首先借助巯基试剂在纳米金颗粒表面修饰生物活性物质Mb, 纳米颗粒引入了特定的功能团, 有利于生物分子的稳定结合, 并能减少非特异性的结合, 修饰的自组装膜使纳米颗粒在液相中均匀分散, 将纳米颗粒固化到电极表面后, 也能保持均匀分散, 有效抑制了纳米颗粒的团聚.然后, 以单层自组装和层层自组装的方式, 将同时修饰有生物活性物质Mb和巯基试剂的纳米金颗粒固定到裸金电极表面, 并在其表面配位二价铜离子, 电极表面形成致密有序的三维自组装膜结构.最后, 采用循环伏安法(CV)、交流阻抗法(EIS)以及电流-时间曲线法(I-t)等电化学测试手段, 表征各修饰电极作为生物传感器的修饰过程、修饰效果以及对于H2O2的还原能力.
1 实验部分 1.1 仪器与试剂CHI630电化学工作站, 上海辰华仪器公司; UV-2550型全波长紫外可见分光光度计, 日本岛津公司; F-7000型傅里叶红外吸收光谱仪, 日本日立公司.电化学测试中, 电化学体系均为三电极体系, 其中对电极为铂丝电极, 参比电极为Ag/AgCl电极, 工作电极为直径3 mm金盘电极(以上电极均购自天津艾达恒晟工贸有限公司).
β-巯基乙胺、N-乙基-N’-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)均购自阿拉丁试剂公司, 分析纯; 四氯金酸(HAuCl4·4H2O)购自国药集团化学试剂有限公司, 分析纯; 其余所有试剂均为分析纯, 使用前无需纯化.实验过程中使用的缓冲液为0.02 mol/L的磷酸盐缓冲液(pH 6.4), 配制溶液的水均为去离子水.实验用水为二次蒸馏水.
1.2 Mb功能化纳米金的制备试验中, 根据文献[2]进行Mb制备和分离纯化, 经冷冻干燥后, 得到浓度0.025 mol/L的Mb溶液.根据文献, 采用Mb还原HAuCl4.4H2O的生物法, 制备修饰有Mb的单分散纳米金(Mb-AuNP), 经扫描电镜测试其直径范围为19.3 ± 5.5 nm.
借助巯基试剂制备Mb功能化纳米金的步骤如下.首先, 根据Frens法制备纯金纳米颗粒, 随着溶液中金纳米颗粒不断的生成, 溶液的颜色变为酒红色, 冷却至室温.然后, 分别将5 μL的β-巯基乙胺溶液缓慢加入至2 mL的AuNPs溶液中, 4 ℃保温24 h.最后, 将Mb溶液加入至上述化学修饰的AuNPs溶液中(摩尔比为1:1), 得到同时修饰有功能活性物质Mb和巯基试剂的Mb功能化纳米金, 即这些金纳米颗粒用于紫外-可见全波长扫描、红外光谱扫描、投射电镜扫描等结构表征和电化学测试[8].所有样品避光4 ℃保存.
1.3 电极修饰与电化学表征 1.3.1 单层自组装修饰电极的制备金电极(Φ= 3 mm)分别经粒径为0.25和0.05 μm的三氧化二铝悬浊液抛光成镜面后, 再先后采用甲醇、水超声清洗30 s.自组装Mb和Mb功能化纳米金前, 先将金电极放入0.5 mol/L H2SO4溶液中于-0.3 ~ +1.5 V范围内循环伏安扫至稳定.
在预处理好的金电极表面, 分别滴加20 μL Mb、Mb-AuNPs和巯基乙胺-AuNPs-Mb溶液, 避光于4 ℃保温16 h后.一方面, 利用功能活性物质Mb结构中赖氨酸基团上的-SH或-NH2与金纳米表面稳定结合; 另一方面, 借助各巯基试剂结构中-SH或-NH2与金溶胶颗粒表面进行结合, 各修饰电极的单层自组装修饰过程模型如图 1所示.运用电化学手段对自组装的方式得到Mb修饰电极、Mb-AuNPs修饰电极和巯基乙胺-AuNPs-Mb修饰电极进行测试.
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图 1 Mb修饰金电极(a)、Mb-AuNPs修饰金电极(b)、Mb-AuNPs-巯基乙胺修饰金电极(c)的单层自组装修饰过程模型 Figure 1 Monolayer self-assembly modification process of the modified gold electrodes (a) Mb modified gold electrode; (b) Mb-AuNPs-modified gold electrode; (c) Mb-AuNPs-mercaptoethylamine modified gold electrode. |
在预处理好的金电极表面, 滴加20 μL的巯基乙胺-AuNPs-Mb溶液, 避光于4 ℃保温16 h后.这样Mb结构中的双巯基或巯基乙胺上的氨基稳定地与金盘电极吸附, 双蒸水冲洗电极表面后N2吹干.将修饰有巯基乙胺-AuNPs-Mb的金盘电极浸泡在10 mL 75 mmol/L EDC和15 mmol/L NHS混合溶液中, 静置3 h.取出后, 双蒸水冲洗电极表面后N2吹干, 再在电极表面滴加20 μL的巯基乙胺-AuNPs-Mb溶液, 如此反复多次.
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图 2 Mb-AuNPs-巯基乙胺修饰金电极的层层自组装修饰过程模型 Figure 2 Multilayer self-assembly modification process of the Mb-AuNPs-mercaptoethylamine modified gold electrode (Note: X is the-NH2 of mercaptoethylamine or the-SH of Mb) |
上述各修饰电极再分别浸泡于0.1 mol/L CuSO4溶液中, 4 ℃保温20 h后, 同样采用电化学方法对配位Cu2+后的各修饰电极进行测试.
1.3.4 修饰电极的电化学测试电化学交流阻抗法(EIS)是在含5.00×10-3 mol/L K3[Fe(CN)6]和5.00×10-3 mol/L K4[Fe(CN)6]的0.1 mol/L KCl为电解液进行测试的.配位Cu离子后的修饰电极循环伏安测试(CV), 电解液为pH值为6.4、0.02 mol/L的PBS缓冲溶液.电测-时间曲线法(I-t)测试是在-200 mV恒定电压状态下进行的, 初始电解液为pH值为6.4、0.02 mol/L的PBS缓冲溶液.所有电化学测试的电极液均采用去离子水配置, 并进行除杂处理.
2 结果与讨论 2.1 UV-vis生物活性物质Mb在全波长扫描图谱中, 在280、340和395 nm波长处分别可以发现其结构中的酪氨酸残基、噁唑酮和咪唑啉酮的吸收峰.当Mb变性或上述Mb官能团与其他物质基团发生配位时, 这些特征峰将减小或消失.金纳米颗粒的吸收波长在530 nm左右(Fig. 3a).如图 3(b)所示, Mb-AuNPs的吸收波长为531 nm, 此时Mb结构中噁唑酮(338 nm)和咪唑啉酮(387 nm)特征峰均显著减小[14-15].然而随着β-巯基乙胺的加入, 金纳米在530 nm处发生微弱的红移, 巯基乙胺-AuNPs-Mb的吸收波长由纯金纳米溶胶的530 nm红移至534 nm处, 并且吸收峰值也发生了微弱减小.这可能是由于Mb和试剂β-巯基乙胺结构中的巯基或氨基与金属发生配位后产生电子迁移所导致的红移现象发生(Fig. 1c, d)[16-20], 也有可能是由于个别邻近的金纳米颗粒间发生团聚现象所导致的吸收峰值减小[21].
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图 3 纯金纳米溶胶(a)mb-AuNPs、(b)巯基乙胺-AuNPs、(c)巯基乙胺-AuNPs-Mb的UV全波长扫描图谱(d) Figure 3 The UV-spectra of pure gold nanoparticles (a), mb-AuNPs (b), mercaptoethylamine -AuNPs (c), Mb functionalized gold nanoparticles (d). (UV全波长扫描范围为200~800 nm; 对照组为去离子水; 插图为Mb的UV全波长扫描图谱) The UV-Visible spectra of were measured in a quartz cuvette operated at a resolution of 1 nm from 200 to 800 nm with a high scanning speed. Deionized water was used as blank. The inset was Mb. |
采用红外光谱扫描进一步指认金纳米颗粒表面配位了生物基团. 图 4(a)中, 可以找到Mb结构中酪氨酸残基、噁唑酮和咪唑啉酮骨架的伸缩振动基团. 图 4(b)中, 借助Mb的还原特性生物法制备的金纳米颗粒, 相应的伸缩振动峰发生显著的减小, 这一结果与文献报道一致[3, 22].采用化学法制备的同时修饰有Mb和巯基试剂的巯基乙胺-AuNPs-Mb, 红外光谱中可以找到Mb结构中官能团骨架的伸缩振动峰, 但振动均发生减小. 3 430 cm-1处是官能团-OH基团的伸缩振动波长. 2 928和2 853 cm-1分别是C=O官能团不对称和-CH2官能团对称的伸缩振动.同时在1 630 cm-1处发现C=C官能团的伸缩振动变化, 而1 043, 1 122和1 261 cm-1处则属于C-O官能团的伸缩振动.然而, 最值得注意的是1 384 cm-1处C—N伸缩振动的增强, 这进一步说明引入的试剂β-巯基乙胺中的-NH2基团修饰在金纳米颗粒表面上.在很大程度上, AuNPs稳定性是取决于其表面的稳定物的, 例如稳定的配合基团或分子.而我们引入的Mb或巯基试剂, 在一定程度上扮演了稳定AuNPs结构或性质的作用.
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图 4 Mb (a)、Mb-AuNPs (b)和巯基乙胺-AuNPs-Mb的红外光谱图 Figure 4 FTIR spectra of Mb (a), Mb-AuNPs (b), Mb functionalized gold nanoparticles (c) |
比较Mb-AuNPs和巯基乙胺-AuNPs-Mb, 发现它们不仅具有Mb的生物活性, 并且AuNPs颗粒为Mb提供了更多的活性位点, 使得Mb拥有更好的空间构象发挥活性.同时, 巯基乙胺-AuNPs-Mb颗粒表面拥有更多的-NH2基团, 可以更好的以自组装形式修饰到裸金电极表面.
2.3 透射电镜投射电镜下观察, 同时修饰有巯基乙胺和Mb的AuNPs颗粒, 分布均匀且粒径均一, 并显著改善了金纳米颗粒团聚现象.
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图 5 巯基乙胺-AuNPs-Mb的投射电镜 Figure 5 The projection electron microscope of Mb-AuNPs-mercaptoethylamine |
试验首先利用EIS法给出电极的修饰过程中电极表面电阻的变化情况, 采用不同的修饰电极于5 mmol/LFe(CN)63-/4-+ 0.1 mol/L KCl + 0.1 mol/L PBS (pH 7. 0)溶液中进行交流阻抗谱测试.从图 6可以看出, 随着Mb、Mb-AuNPs和巯基乙胺-AuNPs-Mb在电极表面单层自组装, 经拟合后的阻抗图谱中的圆弧半径是随之增大的.曲线a.为裸金电极的EIS图, 裸金电极在5 mmol/LFe(CN)63-/4-+ 0.1 mol/L KCl + 0.1 mol/L PBS (pH 7. 0)溶液中的阻抗值最小, 近乎为一条直线, 说明此时电极表面光滑, 无任何物质修饰.当电极自组装修饰Mb后, 其阻抗值增大(曲线b), 这是因为自组装在金电极表面的Mb形成了一层有序致密的膜, 阻碍电极表面与电解液间的电子传输作用.而当电极表面自组装修饰Mb-AuNPs巯基乙胺-AuNPs-Mb后, 其阻抗值进一步增大, 这是由于纳米金属为Mb提供了更多活性位点和空间取向, 使得更多的Mb修饰到了电极表面, 使电子传输更困难, 因而其阻抗值增大.当不同层数{巯基乙胺-AuNPs-Mb}n(n=1, 2, 3, 4)组装到电极上, 随着自组装层数的增加, 交流阻抗值在逐渐增大.
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图 6 各修饰电极的交流阻抗图谱 Figure 6 The electrochemical impedance spectroscopy of modified gold electrodes |
同样, 在5 mmol/LFe(CN)63-/4-+ 0.1 mol/L KCl + 0.1 mol/L PBS (pH 7. 0)溶液中的循环伏安测试(图 7)与EIS的测试结果一致, 各Mb修饰电极随着自组装层数的增加, 在电极表面有更多的物质阻碍电子传递过程, 氧化与还原峰电位对应电流不断降低.
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图 7 裸金电极(a)、Mb修饰金电极(b)、Mb-AuNPs修饰金电极(c)、{巯基乙胺-AuNPs-Mb}n修饰金电极(n=1-4, d-g)于含5.00×10-3 mol/L K3[Fe(CN)6]和5.00×10-3 mol/L K4[Fe(CN)6]的0.1 mol/L KCl溶液中的循环伏安测试, 扫速100 mV·s-1 Figure 7 Cyclic voltammograms was obtained by using 0.1 mol/L KCl solution containing 5.00×10-3 mol/L K3[Fe(CN)6] and 5.00×10-3 mol/L K4[Fe(CN)6] at a 3 mm diameter gold electrode modified by (a) Bare gold electrode, (b) Mb modified gold electrode, (c) Mb-AuNPs modified gold electrode, (d-e) mercaptoethylamine-AuNPs-Mb modified gold electrode(n=1-4). At a scan rate of 100 mV·s-1, respectively |
以100 mV/s的扫描速度, 在pH 6.4、0.02 mol/L的PBS中, 对Mb/Au电极(图 8, 曲线a)、Mb-AuNPs/Au电极(曲线b)和{巯基乙胺-AuNPs-Mb}n/Au电极(n=1, 2, 3, 4;曲线c-f)配位铜离子前后的氧化还原能力进行了测试.在PBS缓冲液中, 裸金电极在CV测试中无氧化还原峰产生.而当Mb以自组装方式修饰到金电极后, 各种电极表面均出现了微弱的氧化还原信号.
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图 8 裸金电极(a)、Mb修饰金电极(b)、Mb-AuNPs修饰金电极(c)、{巯基乙胺-AuNPs-Mb}n修饰金电极(n=1-4, d-g)于pH 6.4的0.02 mol/L PBS溶液中的循环伏安测试, 扫速50 mV·s-1 Figure 8 Cyclic voltammograms obtained from pH 6.4 phosphate buffer (0.02 mol/L) at a 3 mm diameter gold electrode modified by Mb (a), Mb-AuNPs (b), and Mb functionalized gold nanoparticles (c) before and after coordination with copper ion, at a scan rate of 50 mV·s-1, respectively |
然而, 与Mb相比Mb-Cu复合物表现出更强的还原能力.当配位Cu2+后, CV测试下各修饰电极均出现了一对可逆的且对称性较好的氧化峰与还原峰.配位Cu2+后, 对于Mb/Au电极而言, 出现的还原峰与氧化峰电位分别为0.035和0.198 V; Mb-AuNPs/Au电极的还原峰与氧化峰电位分别为0.09和0.205 V; {巯基乙胺-AuNPs-Mb}n(n=1, 2, 3, 4)修饰电极的还原峰与氧化峰出现时的电位分别为0.11和0.21 V、0.11和0.23 V、0.108和0.219 V、0.11和0.213 V[23].层层自组装修饰电极中, {巯基乙胺-AuNPs-Mb}3的氧化与还原电位对应的电流最大, 推测此修饰电极具有最强的还原能力.
一方面, 由β-巯基乙胺提供的巯基、氨基基团与Mb修饰在金纳米颗粒表面, 进而在裸金电极表面形成有序的单分子自组装膜.这种化学修饰调整了Mb在AuNPs表面的分布密度、空间取向, 有可能得到了更易让Mb活性位点与电极发生电子迁移的空间轨道, 表现出更有效的催化还原能力.
另一方面, 随着层层自组装中修饰层数的增加, 修饰电极的氧化与还原能力增加; 但当层数为4层时, 却又有略微的降低.金属纳米粒子有独特的量子尺寸效应和表面效应, 能显著增加生物催化过程中的电子迁移速度, 随着层数的增加, 各Mb-Cu修饰电极的氧化还原能力增加.然而, 当电极表面饱和时, 过于致密的空间排布反阻碍了氧化还原反应过程中的电子迁移能力, 导致电流降低[23].
2.5.2 I-t法测试电极对H2O2的催化还原图 9为不同修饰电极对H2O2的计时电流响应.由图可以看出, 随着过氧化氢量的增加, 4条曲线的安培电流在逐渐增大, 说明修饰有巯基乙胺-AuNPs-Mb的单层及层层自组装电极对过氧化氢发生还原反应均有催化能力.随着{巯基乙胺-AuNPs-Mb}n自组装层数的增多, 修饰电极对H2O2的计时响应电流逐渐增大, 灵敏度增加; 当n增加到4时, 响应电流略有减小, 表明修饰电极对活性物质Mb的固载已基本饱和.电极表面过多的甲烷氧化菌素会增大电极膜的电阻, 阻碍电子的传递, 进而引起传感器的响应时间延长, 线性范围变窄; 而当n=3时, 电极的响应电流最大, 且有较高的灵敏度. {巯基乙胺-AuNPs-Mb}3 /Au修饰电极对H2O2的响应迅速, 响应时间大约为2 s.当浓度为5.29×10-5~6.4×10-4 mol/L时, 传感器响应电流与H2O2浓度呈线性关系, 相关系数为0.992.该生物传感器的米氏常数KMapp为0.787 mmol/L, 该数值较低, 说明其对H2O2的催化性能较好.与其他研究报道的传感器相比, 例如以同时修饰有血红蛋白和纳米金为基元的传感器[25-27]、同时固定有辣根过氧化物酶和纳米金的生物传感器[28-31], 对比结果显示该生物传感器也具有较好的催化效果.
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图 9 {巯基乙胺-AuNPs-Mb}n修饰金电极(n=1-4)于pH 6.4的0.02 mol/L PBS溶液中的计时电流(插图为{巯基乙胺-AuNPs-Mb}3/Au电极的检测电流与的测试H2O2浓度关系) Figure 9 Amperometric response of the H2O2 biosensor to successive addition of H2O2 0.02 mol/L PBS 6.4 solution at the working potential of -0.2 V. Inset shows the calibration plot between the current and the concentration of H2O2. |
该修饰电极可在pH 6.4 PBS溶液中4 ℃保存两周后, 保留90%的催化还原H2O2的能力.当检测底物H2O2浓度高于5.0×10-3 mol/L时, {巯基乙胺-AuNPs-Mb}3 /Au修饰电极检测时会出现钝化现象.
3 结论借助β-巯基乙胺与金纳米颗粒, 制备出保持有Mb生物活性的功能化金纳米巯基乙胺-AuNPs-Mb.采用UV-Vis、红外光谱和投射电镜表征其结构, 该纳米颗粒分布均匀且粒径均一, 并显著改善了金纳米颗粒团聚现象.以Mb功能化金纳米为基元, 采用单层及层层自组装方式将其修饰到裸金电极表面, 形成致密有序的三维自组装膜结构.配位2价铜离子后, 修饰有Mb的单层及层层自组装修饰的氧化还原能力均显著提升, 其中{巯基乙胺-AuNPs-Mb}3 /Au修饰电极作为一种新型H2O2生物传感器, 响应时间大约为2 s, 米氏常数KMapp为0.787 mmol/L, 表现出了较强的还原H2O2的催化活性, 且稳定性较好.
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