2018, Vol. 32
β-脲基巴豆酸酯是合成6-甲基嘧啶二酮衍生物及3, 4-二氢嘧啶二酮衍生物的重要中间体, 6-甲基嘧啶二酮衍生物具有选择性抗肿瘤、抗病毒、抗结核和抗真菌活性[1-2], 而3, 4-二氢嘧啶二酮衍生物具有钙通道阻断[3]、抗菌[4]和抗病毒[5]等生物活性.但关于β-脲基巴豆酸酯合成的报道却很少, 虽有报道用氯化锑[6]、三氟甲磺酸锌[7]和盐酸[8]等作催化剂合成该类物质, 但反应条件较苛刻, 所以寻找温和的合成方法仍具有积极意义.酶作为生物体内大量生化反应的催化剂, 其绿色、安全、高效的催化性能已得到化学家们的广泛关注, 并将酶的非专一性运用到多种有机合成反应中且取得了较好的效果[9-12], 例如水解酶的天然功能是催化化学键的断裂, 然而近些年来的研究表明, 水解酶同样可催化化学键的形成[13-14], 并已成功应用于C—C[15-16]键、C-杂[17-18]原子键的构建及氧化[19]、过氧化[20]、聚合[21]等多种类型的化学反应中.于是, 我们以α-糜蛋白酶为生物催化剂, 通过1, 3-二羰基化合物和脲的缩合反应, 合成了一系列β-脲基巴豆酸酯类化合物, 反应过程如图 1所示.
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图 1 β-脲基巴豆酸酯的合成 Figure 1 Synthesis of β-uramino crotonic ester |
乙酰乙酸乙酯(AR, 98%)、丙酰乙酸甲酯(AR, 98%)、丁酰乙酸乙酯(AR, 97%)、尿素(AR, 99%)、硫脲(AR, 99%)、N-甲基脲(AR, 98%)、氘代DMSO(氘代率99.9% +体积分数0.03% TMS)和α-糜蛋白酶(800 usp U/mg), 上海阿拉丁生化科技股份有限公司; 其它试剂均为国产AR.所有试剂使用前未经任何处理.
WRS-2A型微机熔点仪, 上海仪电物理光学仪器有限公司(使用前温度未经校正, 起始温度为60 ℃, 升温速率为1 ℃/min); Bruker AV Ⅱ-600型核磁共振波谱仪, 瑞士Bruker公司, 扫场范围为1H: -1~14 ppm, 13C: -10~230 ppm. LTQ-XL型线性离子阱质谱仪, 美国Thermo-Fisher公司, 配有Xcalibur型数据处理系统, 甲醇(美国Fisher公司), 质谱扫描范围m/z 50-500;喷雾电压为1.0 kV, 金属毛细管温度150 ℃, ESI喷雾气(N2)压力1.0 MPa, 载气(N2)压力为0.2 MPa; 萃取剂通过进样泵进样, 流速3 μL/min; 串联质谱分析时, 母离子的隔离宽度1.0 μm, 碰撞时间30 ms, 碰撞能量20%;其他参数由LTQ-MS系统自动优化.
1.2 β-脲基巴豆酸酯的合成在10 mL具塞锥形瓶中, 加入3 mmol乙酰乙酸乙酯、1 mmol尿素、20 mg α-糜蛋白酶和3 mL N, N-二甲基甲酰胺, 于37 ℃恒温摇床(200 r/min)中反应48 h, 经硅胶填充的吸附柱色谱分离(Vpetroleum ether: Vethyl acetate=2:1)得到目标产物, 并用1H NMR和HR-MS进行了结构表征, 产率为柱色谱分离产率.
2 结果与讨论 2.1 催化剂对酶促反应的影响催化剂是影响反应的关键因素, 所以研究了酶的种类对反应的影响, 以乙酰乙酸乙酯和尿素作为模板反应来研究各种酶的催化效率, 在相同的反应条件下, 只有α-糜蛋白酶能催化乙酰乙酸乙酯和尿素反应, 得到33%的β-脲基巴豆酸酯, 结果见表 1.因此, 选择α-糜蛋白酶作为最佳催化剂进行后续研究.
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表 1 不同酶对模板反应的催化效果a Table 1 The catalytic effect of various enzymes for the model reactiona |
溶剂是影响化学反应的重要因素, 因此又考察了溶剂对模板反应的影响.由表 2可知, α-糜蛋白酶在DMF和DMSO等非质子溶剂催化活性较好, 最高可取得33%的产率; 而在甲醇、乙醇和水等质子溶剂无产物生成, 这可能是溶剂影响了酶的活性和稳定性所致, 而溶剂Log P值对反应的影响并无明显的规律性, 最终选择DMF为溶剂进行后续研究.
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表 2 溶剂对模板反应产率的影响a Table 2 Effect of solvent on the yield of model reactiona |
选用乙酰乙酸乙酯和尿素为模板反应底物, 首先考察了底物摩尔比对反应效果的影响, 结果见表 3.尿素过量时反应效果较差, 而随着乙酰乙酸乙酯用量的增加产率不断提高, 当乙酰乙酸乙酯:尿素=3:1时产率取得最大值33%, 之后, 再增加乙酰乙酸乙酯用量产率反而降低.所以选择了乙酰乙酸乙酯:尿素=3:1为最佳底物摩尔比.
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表 3 底物摩尔比对模板反应产率的影响a Table 3 Effect of molar ratio on the yield of model reactiona |
温度不仅影响化学反应速率, 也是影响酶活性的重要因素, 因此又考察了温度对模板反应的影响, 结果见表 4.随着温度升高反应产率也逐渐升高, 当温度为37 ℃时产率取得最大值, 之后再升高温度产率反而降低.因为酶是生物催化剂, 过高的温度会使酶蛋白变性失活, 从而影响其催化性能, 导致反应产率降低.因此, 最终选择37 ℃作为最佳反应温度.
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表 4 温度对模板反应产率的影响a Table 4 Effect of temperature on the yield of model reactiona |
最后又对催化剂用量进行了优化, 结果见表 5.不加催化剂时, 没有产物生成, 当用5 mg的α-糜蛋白酶作催化剂时, 取得了7%的产率; 当酶用量增加至20 mg时, 产率达到了最大值.因此, 最终选择20 mg为最佳酶用量.
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表 5 催化剂用量对模板反应产率的影响a Table 5 Effect of enzyme loading on the yield of model reactiona |
在确定了酶促反应的最佳条件后, 又选取了一系列β-二羰基化合物和脲进行反应, 以考察该方法的底物普适性.由表 6实验数据可知, α-糜蛋白酶可以催化多种二羰基化合物和脲的缩合反应合成β-脲基巴豆酸酯类化合物; 同时也可以看出二羰基化合物和脲的结构对反应产率有较大影响.硫脲的反应效果较尿素和甲基脲好, 且产率受二羰基化合物结构影响较小(表 6, 序号2, 5, 8);当二羰基化合物与甲基脲反应时, 区域选择性较好, 分别只得到了Ⅲc1、Ⅲf1和Ⅲi1(表 6, 序号3, 6, 9);丁酰乙酸乙酯与脲反应时的产率相对较低, 可能是受空间效应的影响(表 6, 序号7, 8).
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表 6 α-糜蛋白酶催化合成β-脲基巴豆酸酯a Table 6 α-Chymotrypsin-catalyzed synthesis of β-uramino crotonic estersa |
Ⅲa:白色固体. 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ: 10.14 (s, 1H), 6.80 (s, 2H), 4.75 (s, 1H), 4.06 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 2.24 (s, 3H), 1.18 (t, J = 7.1 Hz, 3H). ESI -HRMS: m/z, [C7H12N2O3 + H]+计算值: 173.085, 测定值: 173.091.
Ⅲb:白色固体. 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ: 11.09 (s, 1H), 6.90 (s, 2H), 5.45 (s, 1H), 4.06 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 2.24 (s, 3H), 1.18 (t, J=7.1 Hz, 3H). ESI -HRMS: m/z, [C7H12N2O2S+ H]-计算值: 187.062, 测定值: 187.053.
Ⅲc1:白色固体. 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ: 10.87 (s, 1H), 7.73 (s, 1H), 4.77 (s, 1H), 4.06 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 2.77 (s, 3H), 2.30 (s, 3H), 1.19 (t, J = 7.1 Hz, 3H). ESI -HRMS: m/z, [C8H14N2O3 + H]+计算值: 187.100, 测定值: 187.108.
Ⅲd:白色固体. 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ: 10.13 (s, 1H), 6.80 (s, 2H), 4.75 (s, 1H), 3.79 (s, 3H), 2.84 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 1.20 (t, J = 7.1 Hz, 3H). ESI -HRMS: m/z, [C7H12N2O3 + H]+计算值: 173.085, 测定值: 173.092.
Ⅲe:白色固体. 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ: 11.13 (s, 1H), 7.10 (s, 2H), 4.75 (s, 1H), 3.79 (s, 3H), 2.84 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 1.19 (t, J = 7.1 Hz, 3H). ESI -HRMS: m/z, [C7H12N2O2S + H]+计算值: 188.062, 测定值: 188.059.
Ⅲf1:白色固体. 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 10.65 (s, 1H), 6.95 (s, 1H), 4.75 (s, 1H), 3.79 (s, 3H), 2.84 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 2.75 (s, 3H), 1.20 (t, J = 7.1 Hz, 3H). ESI -HRMS: m/z, [C8H14N2O3 + H]+计算值: 187.100, 测定值: 187.107.
Ⅲg:白色固体. 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ: 10.14 (s, 1H), 6.80 (s, 2H), 4.75 (s, 1H), 4.05 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 2.01 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.36 (m, 2H), 1.18 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 0.93 (t, J = 7.4 Hz, 3H). ESI -HRMS: m/z, [C9H16N2O3 + H]+计算值: 201.116, 测定值: 201.123.
Ⅲh:白色固体. 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ: 11.14 (s, 1H), 7.10 (s, 2H), 4.75 (s, 1H), 4.05 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 2.01 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.36 (m, 2H), 1.18 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 0.93 (t, J = 7.4 Hz, 3H). ESI -HRMS: m/z, [C9H16N2O2S + H]-计算值: 215.093, 测定值: 215.034.
Ⅲi:白色固体. 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ: 10.25 (s, 1H), 6.91 (s, 1H), 4.75 (s, 1H), 4.05 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 2.76 (s, 3H), 2.01 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.36 (m, 2H), 1.18 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 0.93 (t, J = 7.4 Hz, 3H). ESI -HRMS: m/z, [C10H18N2O3 + H]+计算值: 215.132, 测定值: 215.139.
2.7 反应机理的推测α-糜蛋白酶属于肽酶S1族的丝氨酸蛋白酶, 由3个通过二硫键链接的多肽链组成, A链(Cys1-Leu13), B链(Ile16-Tyr146)和C链(Ala149-Asn245), A链是13个残基的短链, 而B和C链分别含有131和97个残基[22].催化三联体由His57、Asp102和Ser195组成[23-24].参照相关文献[25], 推测出了α-糜蛋白酶催化合成β-脲基巴豆酸酯类化合物的可能机理.如图 2所示, His57先夺取脲氨基上的质子, 使脲作为亲核试剂进攻被Ser195通过氢键活化了的羰基, 生成一个过渡态的化合物, 之后再通过Ser195发生脱水生成β-脲基巴豆酸酯.
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图 2 α-糜蛋白酶催化合成β-脲基巴豆酸酯的可能机理 Figure 2 Proposed mechanism for α-chymotrypsin-catalyzed synthesis of β-uramino crotonic ester |
我们建立了一种生物催化合成β-脲基巴豆酸酯类化合物的新方法, 并对可能的催化机理进行了推测; 该方法反应条件较为温和, 符合绿色化学的基本理念; 但该方法的产率还较低, 底物适用范围也有待拓展.该研究进一步拓展了酶非专一性的应用范围, 对推动生物催化在有机合成中的应用具有积极意义.
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