2018, Vol. 32
2. 中国科学院兰州化学物理研究所 羰基合成与选择氧化国家重点实验室, 甘肃 兰州 730000
2. State Key Laboratory for Oxo Synthesis and Selective Oxidation, Lanzhou Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Lanzhou 730000, China
甲烷氧化菌能够向周围环境中释放一种小分子荧光肽甲烷氧化菌素(Methanobactin, Mb)用来捕捉周围微量的铜, Mb与铜结合会被甲烷氧化菌重新识别吸收并将铜富集在菌体中供颗粒性甲烷单加氧酶(particulate methane monooxygenase, pMMO)表达[1]. Mb在pMMO催化甲烷氧化中起到促进由NADH等电子供体向pMMO传递的作用, 同时Mb还具有歧化超氧阴离子(O2-·)转变为H2O2的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性[2].我们[3]的前期工作还发现M. trichosporium 3011释放出的Mb只有与铜离子结合时才能表现出SOD活性. Grabar等[4-5]研究发现纳米金(gold nanoparticles, AuNPs)与有机物分子中的巯基可以形成作用力较强的共价配位键, 为酶分子以纳米金为载体用Mb对其修饰提供了有效的途径.我们采用铜离子配位的甲烷氧化菌素功能化纳米金模拟SOD就可以从非天然酶角度获得新型高效模拟SOD金属配合物结构信息, 设计合成出高效的SOD模拟酶.借助11-巯基十一烷酸(11-mercaptoundecanoic acid, MUA)在AuNPs颗粒表面修饰上具有生物活性物质Mb, 在纳米金上引入了某些特定的功能团如-SH、-COOH等, 均会维持生物分子的空间构型, 从而降低了非特异性的结合, 由于自组装膜使纳米金均匀分散, 当将纳米金修饰到电极表面后, 也会均匀分散, 有效降低了纳米金的团聚.
目前, 超氧阴离子检测的方法包括黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶法[6]、邻苯三酚自氧化法[7]、核黄素-NBT法[8]和细胞色素C还原法[9]等.但是由于O2-·的不稳定及产物浓度的不确定性, 为寻找能够稳定产生超氧阴离子的体系, 本实验通过二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)在低水分含量的碱性条件下可以产生O2-·[10], 其产生的过程为:
| $ \begin{array}{l} 2{\rm{O}}{{\rm{H}}^ - } + 3{{\rm{O}}_2} + 2{({\rm{C}}{{\rm{H}}_3})_2}{\rm{SO}} \to 2{\rm{C}}{{\rm{H}}_2}{\rm{SOOH}} + \\ {\rm{C}}{{\rm{H}}_2}{\rm{OOH}} + 2{O_2}^{ - \cdot} \end{array} $ | (1) |
利用甲基弯菌M. trichosporium IMV 3011作为实验菌种进行发酵培养, 获得Mb, 并将其与Cu2+和AuNPs结合所形成团簇修饰到裸金电极上, 从而制备出具甲烷氧化菌素功能化纳米金修饰电极, 通过考察修饰电极在DMSO条件下歧化O2-·的电化学行为.
1 实验部分 1.1 主要试剂与仪器11-巯基十一烷酸购自阿拉丁试剂公司, 分析纯; 四氯金酸(HAuCl4·4H2O)购自国药集团化学试剂有限公司, 分析纯; 二甲基亚砜购自北京索莱科技有限公司, 其余所有试剂均为分析纯.实验用水为双蒸水.
12-CHI630电化学工作站, 上海辰华仪器公司; UV-2550型全波长紫外可见分光光度计, 日本岛津公司.电化学测试中, 电化学体系均为三电极体系, 其中对电极为铂丝电极, 参比电极为Ag/AgCl电极, 工作电极为直径3 mm金盘电极(以上电极均购自天津艾达恒晟工贸有限公司).
1.2 不同纳米金团簇的制备根据文献[11-12]进行Mb的制备和分离纯化, 通过冷冻干燥后, 得到Mb固体.在加水复溶通过铬天青S法测得Mb溶液[13]浓度为0.025 mol/L.并利用Frens法制备出酒红色的AuNPs溶液[14].然后, 向AuNPs溶液中分别滴加配制好的Mb溶液和5 mmol/L MUA溶液.所制备好的纳米团簇利用UV-Vis进行结构表征并用于电化学测试.其制备方法如表 1所示.
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表 1 不同纳米团簇的制备 Table 1 Preparation of differentnano-clusters |
一般在纳米金表面组装的是长链巯基化合物, 当长链巯基化合物在纳米金表面组装的时候可能发生弯曲缠绕的现象.我们利用混合自组装方式制备的修饰电极就可防止这种现象的产生[15-16].将金电极(Φ=3 mm)分别利用0.25和0.05 μm粒径的氧化铝悬浊液抛光裸金电极(Φ=3 mm)成镜面, 再依次通过甲醇、水超声清洗0.5 min.将打磨好的裸金电极在电位为-0.3~+1.5 V的范围1 mol/L H2SO4溶液中于循环伏安扫直至稳定, 从而得到预处理好的裸金电极.
向预处理好的裸金电极表面滴加20 μL Mb-AuNPs-MUA溶液, 避光, 置于4 ℃环境下进行组装18 h.测试前用双蒸水冲洗并用N2吹干, 从而得到制备好的修饰电极以进行电化学测定.
1.3.2 修饰电极表面配位Cu2+将上述制备好的修饰电极用双蒸水冲洗后再用N2吹干.并将其分别浸泡在0.1 mol /L CuSO4溶液中, 在4 ℃环境下修饰20 h.同样通过电化学方法对被Cu2+配位后的修饰电极进行测试.
1.3.3 修饰电极的电化学测定采用5×10-3 mol/L K3[Fe(CN)6] + 5×10-3 mol/L K4[Fe(CN)6]+0.1 mol/L KCl溶液作为电化学测定的交流阻抗法(AC impedance method, EIS)与循环伏安法(Cyclic Voltammetry, CV)的测定用溶液.以用来表征所制备修饰电极的电化学行为.
利用DMSO(4Å分子筛除水)中通30 min氧气的溶液作为修饰电极(Cu2+/ Mb-AuNPs -MUA /Au)歧化超氧阴离子的电化学测定溶液, 通过添加NaOH水溶液或是改变扫速, 利用循环伏安法对该反应体系的动力学进行测定.
2 结果与讨论 2.1 纳米团簇的紫外-可见光谱实验表明纳米金在520 nm处有最强等离子共振峰.如图 1所示, Mb-AuNPs的等离子振动峰发生微弱的红移, 吸收波长变为525 nm, 此时是由于Mb的加入AuNPs与Mb表面上的二硫键结合, 进而纳米金稍有团聚发生微弱红移.然而随着MUA与Mb的加入, 金纳米在520 nm的等离子振动峰发生明显减小并发生明显红移, 最终MUA-AuNPs-Mb的纳米团簇吸收波长由纯金纳米溶胶的520红移至624 nm处[17-18].这可能是由于Mb与MUA结构中的巯基与金属发生配位后产生电子迁移所导致的红移现象发生, 也有可能是由于个别邻近的金纳米颗粒间发生团聚现象所导致的吸收峰值减小.
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图 1 不同纳米金团簇紫外光谱 Figure 1 UV Spectra of different nano-gold cluster |
为弄清修饰电极上的组装行为, 以Fe(CN)63-/ Fe(CN)64-为探针溶液, 研究Mb-AuNPs、Mb-MUA、Mb-AuNPs-MUA修饰电极的电化学行为. 图 2分别为Mb-AuNPs、Mb-MUA、Mb-AuNPs-MUA修饰电极的循环伏安曲线.通过CV曲线可以看出, 氧化还原峰电流与裸金电极相比变小, 这是由于当纳米团簇修饰到电极, 会降低探针溶液氧化还原反应物在电极上的氧化还原反应.
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图 2 修饰电极在0.1 KCl和5 mmol/L Fe(CN)63-/ Fe(CN)64-水溶液中的循环伏安 Figure 2 Cyclicvoltammetry of modified electrode in 0.1 mol/L KCl and 5 mmol/L Fe(CN)63-/ Fe(CN)64- solution |
同时从图 3(EIS图)可以看出, 当修饰上纳米粒子后, 高频区半圆直径明显增大.裸金电极、Mb-MUA、Mb-AuNPs、Mb-AuNPs-MUA这4种电极的电子传递电阻Rct分别为740、1984、1342和4522 Ω·cm2.结果显示, 当功能性纳米金修饰到电极上时, 电子传递电阻明显增大, 这可以表明纳米粒子对跨膜电子传递阻力作用增强, 也表示了纳米粒子修饰到了裸金电极, 同时与Liu等[19]利用纳米银制备出的修饰电极(AgNPs/SDS-MWCNTs), Braik等[20]利用碳纳米管与3, 4-亚乙二氧基噻吩制备的修饰电极所测定结果一致.
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图 3 修饰电极在0.1 mol/L KCl和5 mmol/L Fe(CN)63-/ Fe(CN)64-溶液中的交流阻抗 Figure 3 AC impedance of modified electrode in 0.1 mol/L KCl and 5 mmol/L Fe(CN)63-/ Fe(CN)64- solution |
修饰电极在DMSO/NaOH体系中对超氧阴离子的循环伏安曲线如图 4所示.
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图 4 修饰电极在DMSO体系中对O2-·循环伏安图 Figure 4 Cyclic voltammetry of modified electrode in DMSO system for O2-· |
从图 4可知, 在加入NaOH液与未加入NaOH溶液的反应体系中的循环伏安曲线有着明显变化.加入NaOH后看到了明显的氧化还原峰, 峰电流由1.072×10-7A增加到5.69×10-5A.试验结果表明, 修饰电极Cu2+/Mb-MUA-AuNPs/Au在DMSO/NaOH体系中对超氧阴离子有明显的催化歧化作用.这可能是由于修饰电极中的纳米粒子高的比表面积大大提高Mb的固定量, 提高了电极表面电信号[21].
2.4 修饰电极歧化O2-·的动力学 2.4.1 电子转移系数α的测定修饰电极Cu2+/Mb-MUA-AuNPs/Au在不同扫速下对加有5 μL 5 mmol/L氢氧化钠的DMSO溶液中进行循环伏安扫描, 随着扫速的增大发现氧化峰电位Epa增大还原峰电位Epc减小, 进而可得到Epa与Epc随着logν变化的直线关系图(如图 5).并对其直线进行线性拟合得到线性回归方程, 其直线斜率分别为ka=0.5374, kc=-0.6981, 并根据公式(2)、(3)求得修饰电极Cu2+/Mb-MUA-AuNPs/Au在DMSO/NaOH体系中的电子转移速率系数α为0.435[22].
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图 5 修饰电极Cu2+/Mb-MUA-AuNPs/Au在DMSO/NaOH体系中的Epa、Epc与logv的关系 Figure 5 Relationship between Epa, Epc and logv of modified electrode Cu2+/Mb-MUA-AuNPs/Au in DMSO/NaOH system |
| $ {E_{pa}} = constant + \frac{{2.3RT}}{{\left( {1 - \alpha } \right)nF}}logv $ | (2) |
| $ {E_{pc}} = constant + \frac{{2.3RT}}{{\alpha nF}}logv $ | (3) |
其中F为法拉第常数964 84 C/mol, α为代表速率控制步骤中的电子转移系数, R为摩尔气体常数8.3145 J/(mol·K), T为反应温度298 K, ν为扫描速度.
2.4.2 异相电子传递速率常数(Ks)异相电荷传递过程指的是电荷在电极与溶液间的传递过程.当物质在电极上发生电子转移的氧化还原反应时, 电子是在电极与电解质溶液间进行传递, 由于该氧化还原反应发生在两相界面上, 故称为异相反应[24].若电子在两相间的电阻很小, 传递速率快速, 说明该电极过程是可逆的; 反之, 电极过程则为不可逆.我们可以通过异相电子传递速率常数ks来衡量反应难易程度.当ks越大, 体系达到平衡所需时间越短, 氧化还原反应越易进行; 反之, 越难进行[22].由于修饰电极Cu2+/Mb-MUA-AuNPs/Au在DMSO/NaOH体系中反应是一个准可逆过程, 则根据公式(2)-(4)计算[22]求出异相电子传递速率常数ks为0.041 cm/s.
| $ \begin{array}{l} \Delta {E_p} = \frac{{\alpha log\left( {1 - \alpha } \right) + \left( {1 - \alpha } \right)log\alpha - log{K_s} - log\left( {RT/nF} \right)}}{{\alpha \left( {1 - \alpha } \right)nF/2.3RT}} + \\ \quad\quad \frac{{2.3RTlogv}}{{\alpha \left( {1 - \alpha } \right)nF}} \end{array} $ | (4) |
其中F为法拉第常数964 84 C/mol, α为代表速率控制步骤中的电子转移系数, R为摩尔气体常数8.3145 J/(mol·K), T为反应温度298 K, ν为扫描速度.
2.4.3 O2-·与峰电流积分面积的线性关系利用循环伏安法将修饰有铜离子的修饰电极(Cu2+/Mb-AuNPs -MUA / Au)在通有氧气的DMSO溶液中进行测定, 通过O2-·的不同浓度所对应的峰面积, 根据修饰电极在通有氧气的DMSO溶液中于-0.3~+0.6V CV扫描稳定后的曲线, 根据ip与有效积分面积A的关系[22-23]如式5所示.
| $ ip = (2.69 \times {10^5}) \times {n^{3/2}} \times A{D_0}^{1/2}{v^{1/2}}C_0^* $ | (5) |
式中, ip为峰电流, A; A为电极面积cm2; D0为扩散系数, 5.7×10-6 cm2/s; C0*为溶液浓度mol/L; v为扫速V/s.绘制得到以超氧阴离子浓度(X)为横坐标, 峰电流(Y)为纵坐标标准曲线, 结果如图 6所示.
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图 6 超氧阴离子标准曲线 Figure 6 Standard curve of superoxide anion |
利用Origin软件拟合得到标准曲线为Y=0.059 28X-0.307 48, 相关系数R2为0.9719, 说明在此范围内超氧阴离子浓度与其峰电流呈现出良好的线性关系, 满足分析要求.
2.5 检出限与精密度评价一种分析方法有很多指标, 但其中检出限与精密度是评价分析方法的最主要技术指标.其中检出限(detection limit, LOD)即检测下限, 是指某一分析方法在给定的置信度能够被检出待测物质的最低量[26].我们利用Mb功能化纳米金所制备出的修饰电极以信噪比S/N=3确定该方法的检出限为1.129×10-3 μmol/L, 以信噪比S/N=10确定该方法的检出限为3.683 ×10-3 μmol/L.远低于武聪[27]制备Mn-SOD模拟物、诸晓晨[28]制备多空纳米金膜SOD模拟物、Tang等[29]利用合成的Pt-Pd纳米颗粒并修饰到涂有聚多巴胺的石墨烯上所制备的SOD模拟物修饰电极对超氧阴离子的检出限, 其检出限分别为1.27、0.8和2 μmol/L.但稍高于Liu等[17]利用纳米银制备的修饰电极(AgNPs/SDS-MWCNTs)对超氧阴离子的检出限0.0897 nmol/L.
相同的检测条件的DMSO体系中, 不滴加氢氧化钠溶液时进行测定, 并重复9次, 计算检测结果的相对标准偏差, 结果如表 2所示.
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表 2 精密度试验结果 Table 2 Results of precision tests |
由表 2可知, 实验测得结果的相对标准偏差(RSD)为3.83%＜5%, 由此表明该方法具有良好的精密度.
3 结论通过修饰电极Cu2+/Mb-MUA-AuNPs/Au在DMSO/NaOH体系中反应, 研究了修饰电极在该反应体系的直接电化学行为, 该反应体系的检测限在S/N=3时为1.129×10-3 μmol/L, 在S/N=10时为3.683 ×10-3 μmol/L.精密度试验相对标准偏差(RSD)为3.83%.并通过实验计算得到修饰电极Cu2+/Mb-MUA-AuNPs/Au在DMSO/NaOH体系中电子转移系数α为0.435、异相电子传递速率常数Ks为0.041 s-1.
| [1] |
a. Hakemian A S, Rosenzweig A C. The biochemistry of methane oxidation.[J]. Annu Rev Biochem, 2007, 76(1): 233-241. b. Lin Hui-ying(林惠颖), Xin Jia-ying(辛嘉英), Li Chun-yu(李春雨), et al. Progress on isolation and purification of particulate methane monooxygenase(颗粒性甲烷单加氧酶分离纯化方法的研究进展)[J]. J Mol Catal(China)(分子催化), 2018, 32(1): 90-98. c. Zheng Li-na(郑丽娜), Xin Jia-ying(辛嘉英), Wang Yan(王艳), et al. Research progress on the influence of microwave on enzyme-catalyzed reactions and the microwave effect(微波对酶催化反应的影响及其微波效应的研究进展)[J]. J Mol Catal(China)(分子催化), 2017, 31(6): 567-574. d. Li Chun-yu(李春雨), Xin Jia-ying(辛嘉英), Lin Hui-ying(林惠颖), et al. Study on functionalized gold nanoparticles of methanobactin by copper ion coordination uesd as simulated peroxidase(铜离子配位甲烷氧化菌素功能化纳米金模拟过氧化物酶的研究)[J]. J Mol Catal(China)(分子催化), 2017, 31(5): 480-485. |
| [2] |
a. Choi D W, Semrau J D, Antholine W E, et al. Oxidase, superoxide dismutase, and hydrogen peroxide reductase activities of methanobactin from types Ⅰ and Ⅱ methanotrophs[J]. J Inorg Biochem, 2008, 102(8): 1571-1580. b. Hua Shao-feng(华绍烽), Fan Yun-chang(范云场), Zhang Lei(张磊), et al. Reconstitution of an active methane monooxygenase complex from the recombination subunits in vitro(甲烷单加氧酶活性化合物的体外重构)[J]. J Mol Catal(China)(分子催化), 2016, 30(6): 594-598. |
| [3] | Xin J Y, Zhang Y X, Dong J, et al. Production, purification and SOD-like activity of methanobactin from M. trichosporium 3011[J]. Adv Mater Res, 2011, 160/162: 19-23. |
| [4] | Grabar K C, Freeman R G, Hommer M B, et al. Preparation and characterization of Au colloid monolayers[J]. Anal Chem, 1995, 67(4): 735–743. DOI:10.1021/ac00100a008 |
| [5] | Grabar K C, Smith P C, Musick M D, et al. Kinetic control of interparticle spacing in au colloid-based surfaces:rational nanometer-scale architecture[J]. J Am Chem Soc, 1996, 118(5): 1148–1153. DOI:10.1021/ja952233+ |
| [6] | Chen Dong(徐东), Zhao Jian(赵建), Huang Han-chang(黄汉昌), et al. Determination of SOD specific activity in animal and plant tissues by improved xanthine oxidase method(改良的黄嘌呤氧化酶法测定动植物组织中SOD比活力)[J]. Food Sci(食品科学), 2011, 32(6): 237–241. |
| [7] | Chen Lin-lin(陈林林), Zhang Wei(张伟), Wang Zhen-xing(王振兴), et al. Determination of superoxide dismutase activity in methanobactin-copper complexes by pyrogallol autoxidation(邻苯三酚自氧化法测定甲烷氧化菌素-铜配合物的超氧化物歧化酶活性)[J]. J Food Saf Qual(食品安全质量检测学报), 2017, 8(9): 3438–3444. DOI:10.3969/j.issn.2095-0381.2017.09.027 |
| [8] | Wu Lin(伍林), Yan Mi(严敏), Wang Jian-guo(王建国), et al. Synthesis, characterization and simulation of SOD of M(M:Fe(Ⅲ), Cr(Ⅲ), Cu(Ⅱ))-propyl gallate complexes(没食子酸丙酯Fe(Ⅲ)、Cr(Ⅲ)、Cu(Ⅱ)配合物的合成、表征及模拟超氧化物歧化酶)[J]. Chin J Appl Chem(应用化学), 2010, 27(3): 328–332. |
| [9] | Gao Xiao-hui(高晓慧), Tang Jing-jing(唐晶晶), Liu Hao-ran(刘浩然), et al. Improved nitroblue tetrazolium colorimetric method applied to the screening of xanthine oxidase inhibitors(改进硝基四氮唑蓝比色法用于黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选)[J]. J Hunan Normal Univer (Med Sci)(湖南师范大学学报(医学版)), 2016, 13(3): 142–144. |
| [10] | Chen Shi-ming(陈士明), Lu Ya-meng(陆亚蒙), Yan Xiao-min(严小敏), et al. Syudies on production of superoxide radical and its interaction with natural medicine(超氧阴离子自由基的产生及其与天然药物的作用)[J]. J FuDan Univer(Nat Sci)(复旦学报:自然科学版), 1991, 1991(1): 31–36. |
| [11] | Xin Jia-ying(辛嘉英), Dong Jing(董静), Yan Chao-ze(闫超泽), et al. Production and copper acquisition ability of methanobactin(甲烷氧化菌素的产生和铜捕获作用)[J]. Chin Biotechnol(中国生物工程杂志), 2011, 31(8): 40–46. |
| [12] | Behling L A, Hartsel S C, Lewis D E, et al. NMR, mass spectrometry and chemical evidence reveal a different chemical structure for methanobactin that contains oxazolone rings.[J]. J Amer Chem Soc, 2011, 130(38): 12604–12605. |
| [13] | Yan Chao-ze(闫超泽), Zhang Shuai(张帅), Xin Jia-ying(辛嘉英), et al. Study on determination of methanobactin by spectrophotometry using chrome azure S(铬天青S分光光度法测定甲烷氧化菌素的研究)[J]. Anal Test Technol Instrum(分析测试技术与仪器), 2011, 17(2): 69–73. DOI:10.3969/j.issn.1006-3757.2011.02.002 |
| [14] | Zhou Rui-lu(周睿璐), Fu Da-you(付大友), Yuan Dong(袁东), et al. Preparation, characterization and application of gold nanoparticles(纳米金的制备、表征及应用研究)[J]. J Sichuan Univer Sci Eng (Nat Sic Ed)(四川理工学院学报(自科版)), 2016, 29(3): 14–18. |
| [15] | Youssef H, Lucia L A, Rojas O J. Cellulose nano crys-tals:chemistry, self-assembly, and applications[J]. Chem Rev, 2010, 110(6): 3479–3500. DOI:10.1021/cr900339w |
| [16] | Liu Li(刘丽). The research on piezoelectric immu-nosensors based on mixed self-assembled and hyper-branched polymers (基于混合自组装和超支化化合物膜的压电免疫传感器)[D]. Changsha: Hunan University(长沙: 湖南大学), 2007. http://www.wanfangdata.com.cn/details/detail.do?_type=degree&id=D032063 |
| [17] | Vasak M, Kaegi J H R, Hill H A O. Zinc(Ⅱ), cadmium(Ⅱ), and mercury(Ⅱ) thiolate transitions in metallothionein[J]. Biochem, 1981, 20(10): 2852–2856. DOI:10.1021/bi00513a022 |
| [18] | Nielson K B, Winge D R. Order of metal binding in me-tallothionein[J]. J Biol Chem, 1983, 258(21): 13063. |
| [19] | Liu X, Liu X, Wei H, et al. Sensitive detection of superoxide anion released from living cells using silver nano-particles and functionalized multiwalled carbon nanotube composite[J]. Sensors & Actuators B Chemical, 2017, 252: 503–510. |
| [20] | Braik M, Barsan M M, Dridi C, et al. Highly sensitive amperometric enzyme biosensor for detection of supero-xide based on conducting polymer/CNT modified electrodes and superoxide dismutase[J]. Sen & Actu B Chem, 2016, 236: 574–582. |
| [21] | Dou Bo-xin(窦博鑫), Xin Jia-ying(辛嘉英), Fan Hong-chen(范洪臣), et al. Functional self-assembly gold nanoparticle modified electrodes and application in the field of biosensors with enzyme immobilization(功能化金纳米修饰电极自组装及其在固定化酶生物传感器中应用)[J]. J Mol Catal(China)(分子催化), 2016, 30(4): 391–400. |
| [22] | Bi Yan-hua(毕艳华). Electron transfer of biomolecules at bionic interface and spectrofluoroelectrochemistry(仿生界面上生物分子的电子传递和荧光光谱电化学)[D]. Hu-bei: Huazhong University Of Science And Technology(湖北: 华中科技大学), 2006. http://cdmd.cnki.com.cn/article/cdmd-10487-2008022758.htm |
| [23] | Yao Hui-qin(姚慧琴). Studies on electrochemistry, ca-talytic kinetics and electroanalytical method of small bio/pharnaceutical(生物/药物小分子的电化学、电催化动力学及电分析方法研究)[D]. Ning-xia: Ning Xia university (宁夏: 宁夏大学), 2005. http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10749-2005154642.htm |
| [24] | Iyer R N, Schmidt W E. Observations on the direct electrochemistry of bovine copper-zinc superoxide dismutase[J]. Bioelectrochem Bioenerg, 1992, 27(3): 393–404. DOI:10.1016/0302-4598(92)87014-L |
| [25] | Tu Yi(涂毅), Zhao Yuan-di(赵元弟). Electron transfer of biomolecules at nano-materials modified interface(左旋多巴在纳米材料修饰界面上的电子传递)[J]. J HuaZhong normal univer (Nat Sci)(华中师范大学学报(自然科学版)), 2010, 44(1): 86–91. |
| [26] | Liu Yu-quan(刘约权). Modern Instrument Analysis(现代仪器分析)[M]. Beijing: Higher Education Press(北京: 高等教育出版社), 2009: 6. |
| [27] | Wu Cong(武聪). Construction and performance study of a novel superoxide anion electrochemical sensor based on Mn-SOD mimic enzyme(基于Mn-SOD模拟酶的新型超氧阴离子电化学传感器的构建及性能研究)[D]. Hebei: Hebei University of Science and Technology(河北: 河北科技大学), 2017. http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10082-1018021708.htm |
| [28] | Chu Xiao-chen(褚晓晨). Gluocose and superoxide anion electrochemical biosensor research(葡萄糖和超氧阴离子电化学传感器研究)[D]. Hu-nan: Hunan university(湖南: 湖南大学), 2011. http://www.wanfangdata.com.cn/details/detail.do?_type=degree&id=Y1907613 |
| [29] | Tang J, Zhu X, Niu X, et al. Anamperometric supero-xide anion radicalbiosensor based on SOD/PtPd-PDARGO modified electrode[J]. Talanta, 2015, 137: 18–24. DOI:10.1016/j.talanta.2015.01.009 |