2019, Vol. 33
2. 中国科学院兰州物理化学研究所 羰基合成与选择氧化国家重点实验室, 甘肃 兰州 730000
2. State Key Laboratory for Oxo Synthesis & Selective Oxidation, Lanzhou Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Science, Lanzhou 730000, China
氟比洛芬(Flurbiprofen)作为一种丙酸类非甾体类抗炎药(NSAIDs)被广泛应用于临床.氟比洛芬具有一对光学异构体(R, S)-氟比洛芬, 其目前以外消旋混合物形式给药, 然而, 该抗炎药的对映体具有不同的药理活性, 其中S构型抑制还加氧酶的活性, 具有抗炎及止痛的作用, R构型具有抗肿瘤作用, 目前已开展治疗早期老年痴呆症和前列腺癌的研究工作[1].然而, 该药物难以透过血脑屏障到达患处, 并且长期使用后会引起胃肠道的不良反应, 对身体造成一定程度的损害, 因此限制了该药物的应用[2].很多研究者针对该领域进行研究[3-5], 并采取前药策略对药物进行修饰, 主要是通过酯化对原药的羧基进行屏蔽, 从而增加脂肪溶解性、增强其利用度并减少不良反应.
L-抗坏血酸即维生素C(L-Ascorbic acid, VC)是人体必须的维生素, 它具有抗氧化功能, 可以清除体内自由基, 保护机体组织免受氧化损伤.近年来, VC在治疗神经系统退变性疾病方面得到了广泛关注, 并发现VC在脑组织中达到一定浓度时可起到重要的作用[6]. Yi Zhao等[1]针对该方面进行研究, 实验针对几种VC基前药进行药物代谢稳定性及药代动力学研究, 并与原药布洛芬进行比较, 认为这几种VC基前药在通过血脑屏障方面具有优异的传输能力, VC能够被GLUT和SVCT2识别, 并有效的携带原药进入脑部.脂肪酶由于其催化反应条件温和, 反应类型多样且具有良好的立体选择性, 广泛应用于催化药物合成领域[7].近年来, 非水相生物酶催化技术迅速的发展, 许多研究表明脂肪酶在催化药物合成方面具有广泛的应用, 且在非水介质中具有较高活性和稳定性[8], Tomasz等[2]在甲醇中用N435脂肪酶选择性酯化(R, S)-氟比洛芬, 获得的(R)-氟比洛芬甲酯光学纯度高达96.3%.徐文婷等[9]在非水相体系中用脱脂棉固定化黑曲霉脂肪酶合成L-抗坏血酸棕榈酸酯, 产物转化率达到62. 2%. Xin等[10]采用两种立体选择性相反的脂肪酶进行二次拆分, 制备出S型萘普生光学纯度高达96.8%.江南大学汤鲁宏教授等[11-12]使用氟比洛芬作为反应底物, 通过酯化反应进行氟比洛芬维C酯的合成, 反应进行144 h达到平衡状态, 得到产物的质量分数约为6.76%, 反应所需平衡时间较长, 并且转化率较低.为缩短反应所需平衡时间, 提高转化率, 我们以氟比洛芬甲酯为反应底物, 通过酯交换反应合成氟比洛芬维C酯, 对产物结构进行分析, 并对反应体系进行优化.
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图 1 `脂肪酶催化的VC和氟比洛芬甲酯的酯交换反应 Fig.1 Lipase-catalyzed transesterification of VC with Flurbiprofenmethyl ester |
KH-2000型薄层色谱扫描仪；U3000型高效液相色谱仪；Bruker Micro TOF-Q-Ⅱ型质谱仪.
氟比洛芬(上海美岚实业有限公司)；N435脂肪酶(丹麦Novozymes A/S公司)；维生素C及其他有机试剂均为分析纯或化学纯(天津市双船化学试剂厂).
1.2 氟比洛芬甲酯的制备氟比洛芬甲酯的制备采用化学方法, 分别取5 g氟比洛芬、80 mL苯、150 mL无水甲醇和5 mL浓硫酸置于500 mL的圆底烧瓶中, 加热4 h保持溶液处于微沸状态.反应结束后, 为了除去溶液中浓硫酸催化剂和未反应的氟比洛芬, 用5%碳酸氢钠溶液冲洗反应液, 向其中加入石油醚, 用旋转蒸发仪除去有机相即可得到白色固体.采用薄层层析法对氟比洛芬及其甲酯进行定性分析, 先将GF254硅胶板于110 ℃烘箱中活化2 h, 取样点板, 展层剂(氯仿:甲醇:冰醋酸:水=80:10:8:2)中展开, 紫外灯下可观测到产物的黑斑.
1.3 氟比洛芬维C酯的合成及定量分析取适量的氟比洛芬甲酯和VC溶于有机溶剂中, 加入适量的脂肪酶, 并在恒温摇床中反应, 向体系中添加分子筛为控制其水活度小于0.01, 考察有机溶剂种类、催化时间、底物比、脂肪酶添加量、摇床温度和转速对产物转化率的影响.
使用薄层层析法分析产物, 分别各取5 μL反应后样品溶液与氟比洛芬和VC标准液, 点在GF254硅胶板上, 并于室温下置于展开剂(氯仿:甲醇:冰醋酸:水=80:10:8:2)中40 min, 自然风干, 在紫外下观察产物斑点并按照公式(1)进行计算.
转化率计算公式:
| $ C=\frac{{{\mathit{A}}_{\mathit{product}}}}{{{\mathit{A}}_{\mathit{product}}}\mathit{+}{{\mathit{A}}_{\mathit{vitamin}\ \ C}}}\times 100\% $ | (1) |
其中: C——产物转化率；
Aproduct—使用薄层层析法得出的产物的峰面积；
Avitamin C—使用薄层层析法得出的底物的峰面积.
1.4 氟比洛芬维C酯的分离及结构分析 1.4.1 产物的分离通过真空泵滤出反应后的溶液, 除去N435脂肪酶和分子筛, 将溶液旋蒸至干, 研磨得到黄色粉末.用0.2 mol/L的pH 8的磷酸缓冲溶液洗涤并抽滤, 向下清液中加入3 mol/L的盐酸将pH调至4, 静置2 h后抽滤并回收固体, 再用65 ℃的环己烷冲洗, 最终得到淡黄色固体.
1.4.2 高效液相色谱通过配有C18反相柱的高效液相色谱检测产物, 使用参考文献[11]中描述的方法进行检测, 将样品稀释100倍然后进样, 流动相配比为乙腈:水:甲酸=80:20:0.2, 进样量10 μL, 流速1 mL/min；紫外检测波长为294 nm.
1.4.3 质谱质谱的测定是使用Bruker公司的Micro TOF-Q-Ⅱ液质联用仪, 采用电喷雾(Electrospray ionization, ESI)离子源, 正离子模式, 溶剂为乙腈.
2 结果与讨论 2.1 薄层层析色谱分析如下图, 1为不添加脂肪酶的反应样品、2为添加脂肪酶催化的样品、3为氟比洛芬甲酯样品、4为VC标准品、5为氟比洛芬标准品.参考标准品的斑点可知, 图中黑斑由左至右分别是VC、产物、氟比洛芬和氟比洛芬甲酯.通过点1与点2对比我们可以得出结论, 添加N435脂肪酶进行催化可以生成新的物质.
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图 2 产物的薄层层析图 Fig.2 Thin-layer chromatogram of the product |
经高效液相分析得到的色谱图如图 3所示. a是氟比洛芬液相色谱图、b是氟比洛芬甲酯液相色谱图, c是脂肪酶催化酯化反应后溶液的液相色谱图.比较显示酯化反应图中的2号峰是氟比洛芬, 3号峰是氟比洛芬甲酯, 而VC在294 nm的波长下没有紫外吸收, 因此推测1号峰为目标产物氟比洛芬维C酯.
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图 3 高效液相色谱图 Fig.3 HPLC (a. HPLC of flurbiprofen; b. HPLC of flurbiprofenester; c. HPLC of Novozym 435 lipase-catalyzed transesterification) |
通过液质联用仪配套软件计算得到目标产物(M: C21H19O7F)的相对分子质量为402.110.由图 4可见阳离子峰: 425.059(M+Na)、827.123(2M+Na)、441.055(M+K)、843.117(2M+K), 可知M+Na的相对分子质量为425.059, 除去钠元素的相对原子质量, 与计算所得的产物的相对分子质量相符, 确定该物质为目标产物氟比洛芬维C酯.
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图 4 产物的质谱图 Fig.4 Mass spectrum of product |
不同来源的脂肪酶具有的催化特性不尽相同.在实验早期阶段, 分别选取猪胰脂肪酶PPL、固定化嗜热真菌脂肪酶TLIM、固定化南极假丝酵母脂肪酶N435、柱状假丝酵母脂肪酶CRL、木瓜脂肪酶CPL进行催化反应, 发现只有N435脂肪酶能催化酯交换反应.为探索不同有机溶剂对酶催化反应的影响, 分别选用叔丁醇、叔戊醇、乙酸乙酯、丙酮及氯仿进行酯交换反应, 结果如表 1所示.反应底物在不同的有机介质中溶解性不同, 有机溶剂的Log P值较大时VC难以溶解, 同时酶的催化活性与有机溶剂的疏水性也呈正相关, 即有机溶剂的Log P值越大时酶的活性越高, 因为亲水性溶剂能够剥夺维持脂肪酶构象的“必需水”, 会降低酶的活性.综上, 实验选择叔丁醇作为反应溶剂.
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表 1 N435脂肪酶在不同溶剂中催化的转化率 Table 1 The effect of organic solvents on the conversion of N435 lipase-catalyzed reaction |
在催化酯交换反应过程中, 针对反应时间进行了研究, 分别在不同时间取样检测并计算产物的转化率, 得到结果如图 5.由图可看出, 0~28 h时氟比洛芬维C酯的转化率随时间的延长逐渐增加, 反应28 h后产物的转化率趋于平稳, 基本保持不变, 因此酶催化的酯交换反应达到平衡的时间为28 h.
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图 5 反应时间对酯交换反应的影响 Fig.5 The effect of reaction time on the conversion of transesterification (Reaction conditions: flurbiprofen methyl ester (0.57 mmol), VC (0.57 mmol), molecular sieve (0.8 g), tert-butanol (10 mL), Novozym 435 lipase (8%), reaction temperature 50 ℃, shaking at 180 r/min. The reaction time was 48 h and sampled every 4 h) |
底物比率是影响反应平衡的重要参数.固定VC的量不变, 研究改变氟比洛芬的添加量, 如图 6, 可以看出随着氟比洛芬(Flurbiprofen)的增加,产物的转化率逐渐增高, 在底物摩尔比(nVC:nFlurbiprofen)为1:5时转化率达到最大值, 而当底物的量进一步增加时, 产物的转化率呈下降趋势.产生这种现象的原因是增加底物的量可以促进反应向正向进行, 产物逐渐增加, 转化率上升.当底物VC被完全消耗时, 转化率达到最大值.而当底物氟比洛芬甲酯的量继续增加时, 产生了底物抑制作用, 抑制了产物氟比洛芬维C酯的生成, 同时虽然添加分子筛控制反应体系水活度在0.01以下, 但反应体系不是绝对的无水状态, 除产物氟比洛芬维C酯的水解外, 底物氟比洛芬甲酯也会发生水解产生甲醇, 副产物的积累会促进逆反应的发生, 造成转化率下降.
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图 6 底物摩尔比对酯交换反应的影响 Fig.6 The effect of substrates molar ratio on the conversion of transesterification (Reaction conditions: adding different molar ratios of flurbiprofen methyl ester, VC (0.57 mmol), molecular sieve (0.8 g), tert-butanol (10 mL), Novozym 435 lipase (8%), reaction temperature 50 ℃, shaking at 180 r/min, reaction time 28 h) |
为研究N435添加量对酯交换反应的影响, 在底物浓度恒定时, 分别向其中加入相当于底物质量2%~14%的N435脂肪酶, 结果见图 7.从图中得知, 随着脂肪酶添加量的增加, 产物的转化率持续增高并在10%后趋于平缓, 这是由于酶与底物已经充分结合, 继续添加也没有催化位点可供结合, 所以转化率不再升高.
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图 7 酶量对酯交换反应的影响 Fig.7 The effect of lipase amount on the conversion of transesterification (Reaction conditions: flurbiprofen methyl ester (1.71 mmol), VC (0.57 mmol), molecular sieve (0.8 g), tert-butanol (10 mL), reaction temperature 50 ℃, shaking at 180 r/min, reaction time 28 h) |
反应温度会影响酶的催化活性和热稳定性, 是影响化学平衡常数的一个重要参数.因此, 研究了反应温度对酯交换反应的影响.如图 8所示, 转化率随温度的增高而先升高后降低, 这是因为温度越高, 分子热运动越剧烈, 加快催化反应进程, 同时温度升高逐渐达到酶的最适反应温度, 酶活力会增大.但是温度过高, 会导致脂肪酶活性中心结构被破坏, 酶活性下降或失活.因此N435脂肪酶催化氟比洛芬甲酯与VC的酯交换反应中最佳反应温度为70 ℃.
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图 8 温度对酯交换反应的影响 Fig.8 The effect of temperature on the conversion of transesterification (Reaction conditions: flurbiprofen methyl ester (1.71 mmol), VC (0.57 mmol), molecular sieve (0.8 g), tert-butanol (10 mL), Novozym 435 lipase (10%), reaction temperature 40~80 ℃, shaking at 180 r/min, reaction time 28 h) |
摇床的转速对催化体系的传质有一定影响, 如图 9, 产物的转化率随摇床转速的提高先上升后趋于平稳.当转速大于200 r/min时, 底物和酶已充分混合, 消除了外部扩散限制, 转化率基本稳定不再受摇床转速的影响.因此摇床转速以200 r/min为宜.
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图 9 摇床转速对酯交换反应的影响 Fig.9 The effect of rotation speed on the conversion of transesterification (Reaction conditions: flurbiprofen methyl ester (1.71 mmol), VC (0.57 mmol), molecular sieve (0.8 g), tert-butanol (10 mL), Novozym 435 lipase (10%), reaction temperature50 ℃, shaking at 180~260 r/min, reaction time 28 h) |
通过以上实验得到最优反应条件:将0.57 mmol维生素C, 2.84 mmol氟比洛芬甲酯, 0.8 g分子筛及10%的N435脂肪酶加入10 mL叔丁醇中, 于70 ℃, 200 r/min的条件下反应28 h得到目标产物, 在该条件下的转化率达到73.63%.为了探究酶的操作稳定性, 使用同一批次的N435脂肪酶反复进行催化反应, 探究重复次数对对酯交换反应的影响.
由图 10可知, 转化率随着脂肪酶使用次数的增加而逐渐降低, 使用7次后转化率低至37.65%, 说明酶活力不断下降.造成这种现象的原因是脂肪酶在重复使用期间, 不断地清洗和干燥会降低酶活性, 同时在反应过程中长时间浸泡在有机溶剂中, 也会破坏酶的结构, 造成酶活力的损失.
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图 10 N435脂肪酶的稳定性 Fig.10 The stability of N435 lipase |
我们使用非水相体系成功合成氟比洛芬维C酯.在非水相的合成反应中, 使用N435脂肪酶作为生物催化剂, 为了使反应底物能够良好的溶解到反应介质中, 选择叔丁醇作为反应溶剂.在该体系中目标产物能够进行良好的合成反应.通过薄层层析、高效液相色谱、质谱表征产物的结构, 以确定目标产物.然后优化非水相反应体系, 并讨论了有机溶剂类型、反应时间、底物比例等因素的影响, 得到最优反应条件, 目标产物在最优条件下的转化率为73.63%.
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