2020, Vol. 34
随着各种研究方法和技术的不断进步和发展, 不论是化学基础研究还是与其相关的化工[1]、能源[2]、环境[3]、医药[4]等各大领域都对有机合成的发展及其应用提出了较高的要求.有机合成研究内容主要包括反应路线的设计, 合成机理的探究, 催化剂的催化效率, 物质的分离纯化以及结构表征等.其中, 关于催化剂的研究[5]一直以来都广受科技工作者的关注, 它不论是在实验室基础研究中还是在工业生产活动中都具有加快反应速率、提高产率、缩短时间和降低成本的作用.但是, 传统催化剂像酸[6]、碱[7]、过渡金属催化剂[8]等, 存在反应温度高、难溶于有机溶剂、易腐蚀反应容器、难分离、后处理麻烦、催化效率低、污染严重等问题.因此, 设计和寻找新型催化剂[5, 9]成为当下的热门研究领域.
生物催化剂[10]作为一种新型催化剂引起了科学家浓厚的研究兴趣.它是利用酶、微生物细胞或者动植物细胞催化的有机反应, 是一种绿色催化剂, 与非生物催化剂相比, 具有易于在常温常压下反应、反应速率快、催化作用专一、成本低廉等优势, 广泛应用于食品加工[11]、医药[12]、纺织物[13]、生物传感器[14]、生物柴油[15]等工业生产中[16], 还与生命科学[17]的发展密切相关.脂肪酶[18]是一类重要的生物催化剂, 又叫甘油酯水解酶, 属于羧酸酯水解酶类, 能够分解或者合成由高级脂肪酸和丙三醇形成的甘油三酸酯酯键, 同时脂肪酶还是一类特殊的酯键水解酶, 只在异相系统发生催化, 即只在油水界面上催化[19], 而且只有当底物以微粒, 小聚合分散状态或呈乳化颗粒时, 脂肪酶对底物的水解才有显著的催化作用.主要的来源[20]包括动植物和微生物, 植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子, 如蓖麻籽、油菜籽, 动物体内酶则是高等动物的胰脏和脂肪组织, 在肠液中也含有少量的脂肪酶, 来源于微生物的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶, 主要的发酵微生物有黑曲霉, 假丝酵母等.脂肪酶具有较高的催化活性, 比没有催化剂时快100倍以上; 脂肪酶在温和的反应条件下(低温和低压下, pH值介于5~8之间)具有较高活性, 还能减少副反应的发生; 酶具有较高的区域选择性和对映体选择性, 能够催化很多反应类型[21].比如, 脂肪酶能够催化酯的合成[22]、水解[23]、酯交换[24]、醇解[25]和酸解[26]等反应.但由于受到温度、pH值、酶液浓度、溶剂等因素的影响, 游离酶的催化活性很低甚至容易失活.为提高脂肪酶的稳定性和催化活性, 1916年首次报道[27]的固定化酶技术成功的解决了这个问题, 极大地促进了酶与底物的结合, 该方法在过去几十年中也有了显著的发展, 这对工业过程中使用几种酶的经济可行性产生了巨大的经济和科学影响.随着对固定化酶的深入研究发现, 固定化酶还存在一些关键问题, 即脂肪酶固定化在载体上容易堆积从而导致与底物的接触面积减小; 在水相催化中催化三联体的α-螺旋盖处于封闭状态, 致使活性中心未能有效地与底物接触; 固定化酶循环利用次数较少, 回收固定化酶后仍检测到部分游离酶; 均相或者多相催化体系中依旧能检测到失活固定化酶.这些问题对固定化酶的推广使用及生产成本提出了新的挑战.
多孔材料[28]的出现引起了广大科研工作者的关注, 多孔材料是指由封闭或者开放的孔洞构成的平面或立体网络结构的新材料.多孔材料具有很多的优势, 包括较大的比表面积和吸附性能, 可以固定数量较多的酶, 提高酶的荷载量进而提高催化活性, 比如微球或者壳聚糖; 稳定的化学性质, 较高的水热稳定性, 能够提高酶对温度的耐受性, 比如沸石; 骨架的组成可以进行改性调整, 这为设计固定化效果较好的固定化材料提供了条件, 如MOFs[29]、COFs[30]; 较高的吸附量和可控制的吸附性能, 在采用吸附法固定化酶的同时还能将亲水材料调控为疏水材料, 打开α-螺旋盖, 使活性中心与底物充分接触, 比如分子筛[31]、二氧化硅[32]; 孔道规则、大小范围正好在多数分子尺寸范围内, 这对脂肪酶的固定化甚至是生物催化[33-35]的发展具有重要的指导意义, 同时也为工业生产的实用性、经济性提供了有力的技术条件支撑.我们将从各类多孔材料的特性跟固定化酶的效果来进行简要的总结(Fig. 1).
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图 1 多孔材料固定化脂肪酶 Fig.1 Porous material immobilized lipase |
多孔材料主要包括纳米多孔材料、大配体多孔材料、碳骨架多孔材料、氧化硅骨架多孔材料和聚合物类多孔材料等.我们将从以上几个方面系统介绍多孔材料固定化酶的方法、固定化酶活性测定及其固定化酶的催化性能.
多孔材料对酶的固定化方式主要是吸附和共价键接, 交联剂主要用的是戊二醛.第一步是对表面修饰或未修饰过的多孔材料进行处理, 即称取一定质量的多孔材料加入到79~100 mL的磷酸盐缓冲液PBS(0.1 mol/L, pH值为7.0~7.5)或三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸Tris -HCl缓冲溶液(50 mmol/L, pH值为8.0)和25~50 mL的戊二醛溶液(20%, w/v)中, 一般以磷酸盐缓冲溶液用的多, 在250 mL锥形烧瓶中经超声处理2~5 min, 然后在30~35 ℃的振荡培养箱中以180~200 r/min的转速培养0.5~2 h; 第二步是酶的固定化, 称取几十到几百毫克质量的脂肪酶加入到已经处理过的多孔材料缓冲溶液中, 将混合物溶液放在振荡器中培养12 h, 转速在160~200 r/min之间, 温度为37 ℃.随后, 将培养液通过真空过滤, 再用蒸馏水重复洗涤3次, 得到固定化酶.最后, 将该固定化酶在25~35 ℃的真空烘箱中干燥过夜, 或者使用真空冷冻干燥技术得到粉末沉淀, 并在冰箱中以4 ℃低温保存, 以供后续用于活性测试、催化反应.
固定化脂肪酶中蛋白质的量一般通过Bradford法[36]测定, 由未固定化的脂肪酶的量来计算固定的脂肪酶中蛋白质的量, 负荷百分比则通过质量平衡方程式计算：
| $ \begin{array}{l} {\rm{Percentage immobilization = }}\left[ {\left( {{\rm{CiVi - CoVo}}} \right){\rm{/CiVi \times 100\% }}} \right]\\ {\rm{Ci = 初始蛋白质含量}}\left( {{\rm{mg/mL}}} \right)\\ {\rm{Vi = 反应混合物的初始体积}}\left( {{\rm{mL}}} \right)\\ {\rm{Co = 最终蛋白质含量}}\left( {{\rm{mg/mL}}} \right)\\ {\rm{Vo = 反应混合物的终体积}}\left( {{\rm{mL}}} \right) \end{array} $ |
该方法和公式也适用于固定化蛋白酶中的蛋白质量的计算.
而游离和固定化脂肪酶的活性测定是通过将30 mg固定化脂肪酶(或100 mg游离脂肪酶)添加到1 mL 0.1 mol/L PBS(pH 7.0)的试管中, 里面还盛有1 mL 0.5%的对硝基苯基棕榈酸酯和乙醇溶液(w / v), 将试管放置在搅拌器上, 设定温度为37 ℃, 且以160 r/min的转速反应5 min, 再加入1 mL 25 g/L Na2CO3溶液终止反应.取出试管在5000 r/min下冷冻离心10 min, 然后取1 mL上清液并用蒸馏水稀释, 并通过紫外可见分光光度计检测该稀释液在410 nm处的吸光度值.根据朗伯-比尔定律(Beer-Lambert Law), 在与上述相同的条件下, 摩尔吸收系数(410 nm)为14 519 mol/L.一单位活性(U)定义为在以上条件下每分钟可水解1 mmol对硝基苯基棕榈酸酯的酶的量.从其他条件获得的活性定义为相对活性, 我们假设在最佳条件下固定化和游离脂肪酶的最大活性值为100%.在pH 7.0下, 研究了温度(30、40、50、60、70和80 ℃)对游离和固定化脂肪酶活性的影响, 反应时间为1 h.同样的, 在37 ℃下, 研究了pH值(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0)对游离和固定化脂肪酶活性的影响时间, 也是1 h, 每个样品处理重复3遍.
固定化蛋白酶的活性测定则是通过Badhe等人描述的Folin -Lowery方法进行测定, 并作了一些修改.在5 mL磷酸盐缓冲液(pH = 8)中, 添加0.5 mg固定的蛋白酶和0.5 mL酪蛋白溶液, 在35 ℃的振荡培养箱中以180 r/min的转速培养30 min.然后, 加入5 mL三氯乙酸(0.11 mol/L)以终止反应, 最后将反应混合物过滤.过滤后, 再将5 mL碳酸钠和0.5 mL Folin试剂加入到滤液中, 震荡30 min.在35 ℃下, 通过使用UV分光光度计(UV-1800, Shimadzu)在420 nm的波长下测量溶液的吸光度.固定化蛋白酶活性(U)的一个单位定义为在最佳实验条件下产生1 μg·mL-1·min-1酪氨酸所需的固定化酶的量.
固定化脂肪酶的热稳定性测定是通过将生物催化剂加入到0.1 mol/L PBS(pH 7.0)中, 在0到180 min的时间范围内, 以50 ℃的条件进行恒温培育, 每30 min抽取一次该催化剂, 并用于水解p-NPP, 计算水解活性, 而残余活性表示为初始活性的百分比(热培养前的水解活性).
固定化脂肪酶的可重复使用性则通过以下步骤测定, 即在0.1 mol/L pH 7.0磷酸盐缓冲液中, 保持37 ℃的温度不变, 将30 mg固定化脂肪酶加入到p-NPP的乙醇溶液中温和搅拌5 min.在每批反应中, 通过冷冻离心收集固定化的脂肪酶, 用无水乙醇洗涤3次, 氮气吹扫干燥, 再用于下一个循环, 最后通过以上方法计算固定化脂肪酶活性.
1 纳米多孔材料 1.1 磁性纳米多孔材料 1.1.1 磁性纳米粒子磁性纳米粒子是一种跟酶具有较好生物相容性的多孔材料.同时, 磁性Fe3O4具有较高的类似酶的高催化活性, 其较大的比表面积在固定化酶时能提供更多的接触位点, 从而提高固定化酶的量.由于具有磁性, 能够采用更清洁且处理过程简便的物理方法进行分离, 更便于回收利用.
1.1.1.1 磁性纳米粒子固定化脂肪酶2017年, Chen课题组[37]通过聚乙烯基氯(PVBC)对Fe3O4进行修饰, 开发了一种Fe3O4@PVBC(Fe3O4 @聚乙烯基氯)磁性纳米粒子, 能够提高脂肪酶的催化活性和稳定性. Bradford法分析结果表明, Fe3O4@PVBC纳米颗粒上脂肪酶的负载量为162.5 mg蛋白/ g颗粒.固定化脂肪酶的催化活性高达约99.6%, 而游离酶活性为3.3%, 这主要是由于Fe3O4@PVBC纳米颗粒对脂肪酶有较好的界面活化作用.此外, 固定化脂肪酶在重复使用10次后仍能保留其初始活性的69.8%以上.
2019年, Lyu课题组[38]利用醛标记的枯草芽孢杆菌脂肪酶A通过共价连接方式被固定在Fe3O4单分散磁铁矿微球上, 固定化效率超过90%, 而重复反应10次后, 固定化脂肪酶的活性仍能保持在90%.此外, 还大大提高了酶的热稳定性、溶解度并降低了酶凝聚在一起的可能性.通过进一步研究发现, 枯草芽孢杆菌脂肪酶A(BsLA)突变体包含8个改变的氨基酸, 从而提高了酶的溶解度并降低了酶凝的可能性. BsLA8M带有LCTPSR标签, 用于引入醛基.通过席夫碱反应使磁性粒子与BsLA8M共价键合.固定化效率超过90%, 固定化脂肪酶的活性增强(Scheme 1).
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图式 1 LipaseA@Fe3O4生物复合材料催化酯水解反应 Scheme 1 LipaseA@Fe3O4 biocomposite catalyzed ester hydrolysis |
2020年, Mosayebi课题组[39]以辛基对磁性氧化石墨烯进行了功能化修饰, 将纳米复合材料GO-Fe3O4用于玫瑰假丝酵母脂肪酶(CRL-7)的固定化, 随后用于催化对硝基苯基棕榈酸酯与2-丙醇的酯交换反应.结果表明, 固定化脂肪酶的活性为游离酶(34.5 U/mg脂肪酶)的94.7%, 催化酯交换反应的产率为89%, 循环10次后的保留活性为63%, 并提高了热稳定性.另外, 采用(3-氨丙基)三甲氧基硅烷、(3-巯丙基)三甲氧基硅烷和(3-辛基)三甲氧基硅烷功能化GO-Fe3O4纳米复合材料后, GO-Fe3O4固定化CRL7的量分别从未功能化前的187.4 mg/g纳米复合材料增加到328.6、265.3和413.2 mg/g(Scheme 2).
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图式 2 CRL-7@GO-Fe3O4生物复合材料催化酯交换反应 Scheme 2 CRL-7@GO- Fe3O4 biocomposite catalyzed transesterification |
2015年, Butt课题组[40]报道了将灰链霉菌蛋白酶共价交联固定化在磁性纳米颗粒(NMP)上的研究, 该磁性纳米粒子经修饰后表面含有多个羟基.通过戊二醛固定化后, 分别形成了单层的(MNPs-GA-Pro)和多簇的MNPs-PGMA-Pro的生物复合催化剂.与MNPs-GA-Pro相比, MNPs-PGMA-Pro颗粒在较宽的温度和pH范围内均显示出较优的酶活性和稳定性.与游离酶相比, 单层和多簇的MNPs表现出优异的酶活性.当用于对寄生线虫的杀线虫活性测定时, 多簇的MNPs-PGMA-Pro的生物复合催化剂在7个磁分离循环中保持了较高的活性.该生物催化剂可用于水处理, 且具有易磁分离, 可重复使用和降低处理成本的优点.
2017年, Neto课题组[41]报道了将金黄色青霉蛋白酶固定在磁性纳米粒子上的研究, 并利用聚苯胺包被该生物催化剂, 用于水解抗氧化剂肽中的牛酪蛋白.固定的最佳条件是：时间2 h, 固定化蛋白质的量为200 μg/mL, pH为6.3, 活化时间为7.3 h.重复水解牛酪蛋白5次后, 还能保留其原始活性的74%以上, 水解产物的ROS清除活性是非水解酪蛋白的2.5倍以上, 验证了固定化的蛋白酶能够开发对功能性食品具有很大应用潜力的天然成分, 该成分由酪蛋白衍生而来.
1.1.2 磁性纳米花磁性纳米花主要由磁性Fe3O4核和花状有机硅径向皱纹壳组成, 作为固定化酶载体, 磁性Fe3O4核周围所具有的花状有机硅径向褶皱壳层可以减少磁性纳米粒子的不可避免的聚集[42-44]; 较大面积的褶皱层不仅增大了与底物的接触面积, 还能有效地减少固定化酶的流失; 有机硅的疏水性可以促进脂肪酶的催化性能, 即脂肪酶中的两亲性α-螺旋盖子, 可以将活性中心从底物上遮挡起来或在疏水环境中去除, 使活性中心暴露在底物上[45].
2018年, Du等[46]利用磁性有机硅纳米花固定化南极假丝酵母脂肪酶B(CALB), 并用来作为对甘油(GL)和碳酸二甲酯(DMC)反应合成碳酸甘油(GC)的生物催化剂, 当GL与DMC的摩尔比为1:20, 分子筛添加量为0.2 g, 温度为50 ℃并反应24 h为模板反应条件时, 催化剂的催化性能最佳(GC收率88.66%, GL转化率94.24%), 循环7次后, CALB和纳米花生物复合材料还保留初始活性的79%以上, GC产率为70.31%.此外, 由于具有磁性, 可以很方便的利用磁铁对固定化酶复合材料进行回收利用(Scheme 3).
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图式 3 CALB@Nanoflower生物复合材料催化酯交换反应 Scheme 3 CALB@Nanoflower biocomposite catalyzed transesterification |
同年, Ren课题组[47]报道了一种壳聚糖复合水凝胶(PVA-NPC), 该复合水凝胶是由聚乙烯醇(PVA)与壳聚糖(NPC)通过反复冷冻和融化进行物理交联而形成, 进而提高酶-无机杂化纳米花机械强度、催化活性并使其易于分离.用PVA-NPC修饰磁性纳米花, 即纳米花-PVA-NPC复合材料, 再用于对脂肪酶的固定化.水凝胶以网络结构均匀地包覆在脂肪酶-Cu3(PO4)2·3H2O纳米花表面, 底物和产物可以自由移动.水凝胶出色的机械性能有效地保护了脆弱的纳米花免受外部压力, 从而防止酶活性降低.与游离脂肪酶(97.28 U / g)相比, 纳米花-PVA-NPC3在37 ℃和pH 7.4下表现出更高的酶促活性(146.12 U / g), 同时反应结束后易于分离(Scheme 4).
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图式 4 Lipase@PVA-NPC生物复合材料催化酯交换反应 Scheme 4 Lipase@PVA-NPC biocomposite catalyzed transesterification |
2019年, Ren课题组[48]采用共沉淀法成功的将脂肪酶固定化在新型磁性纳米花Cu3(PO4)2上, 即Lipase@MNFs.该磁性纳米花由花状磷酸铜骨架和磁性氧化铁心组成, 在外加磁场的作用下, 磁性纳米花可以快速有效地从反应体系中分离出来.与游离脂肪酶相比, Lipase@MNFs具有较高的酶活性(92.63 U/ g, 37 ℃和pH 7.4), 更好的热稳定性和较佳的pH稳定性(60 ℃和pH 10.0).磁性纳米花的设计为提高脂肪酶的催化活性和稳定性以及简化酶的分离过程开辟了新的途径(Scheme 5).
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图式 5 Lipase@MNF生物复合材料催化酯交换反应 Scheme 5 Lipase@MNF biocomposite catalyzed transesterification |
纳米多孔金(NPG)在固定化酶方面也是具有代表性的材料[49], 对固定化酶有如下优势：(1)作为一种具有微观结构的大体积材料, 固定化酶后, 易于回收利用; (2)具有开放的三维立体结构和较高的表面积, 能够增加固定化酶的空间选择性和固定化效率, 有利于提高酶的吸附性和荷载量; (3)孔径大小范围介于几纳米到几微米之间, 可调控的孔隙率能够对不同大小的酶进行固定化, 对具有特定功能的多种酶分子有较好的选择性; (4)具有良好的生物相容性、清洁性和表面活性, 能够减小酶的表面张力, 增加载体与酶的亲和性, 并有效减缓酶变性.与其他介孔材料相比, NPG具有良好的表面化学特性, 能够提高其功能利用率和导电性, 在多相催化、电催化、燃料电池技术和生物分子传感方面具有广阔的应用前景[50-53].
2013年, Du课题组[54]把脂肪酶固定化在纳米多孔金上, 并将CALB@NPG生物复合材料用于催化对硝基苯基棕榈酸酯(pNPP)的水解反应.结果表明, Lipase@NPG具有较佳的催化活性和显著的可重复使用性.循环10次以后, Lipase@NPG生物复合材料的催化活性没有降低, 回收后发现并没有酶从NPG中浸出.此外, 与游离脂肪酶相比, Lipase@NPG生物复合材料在更宽的pH范围和更高的温度下均具有高催化活性.因此, NPG中酶的包封对于开拓具有新功能的固定化酶技术具有潜在的价值, 并将在不同化学工艺中得到广泛应用(Scheme 6).
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图式 6 CALB@NPG生物复合材料催化酯交换反应 Scheme 6 CALB@NPG biocomposite catalyzed transesterification |
2019年, Chronopoulou Laura课题组[55]提出了将酶固定在纳米载体上的想法, 该方法具有提高酶活性、维持生物催化剂稳定性、促进回收和循环利用的优点.用纳米金和银颗粒(AuNP或AgNP)分别与反式-[二硫代双(三丁基膦)二铂(Ⅱ)4, 4’-二乙炔基联苯](Pt-DEBP)以及有机二硫醇4, 4’-二硫醇-联苯(BI)配合生成反式有机金属双核配合物.生成的配合物都能在3D网络中与纳米金属颗粒相连接, 随后把荧光假单胞菌脂肪酶通过吸附的方式固定化在该纳米金属材料上.在效果最佳的载体AgNPs-PtDEBP上固定化的荧光假单胞菌脂肪酶, 在很宽的温度范围(25~55 ℃)下有较佳的热稳定性; 与可溶形式使用的脂肪酶相比, 该固定化酶在水性介质(50%)和有机介质中均能较好地保留酶活性(Scheme 7).
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图式 7 Lipase@NP生物复合材料催化酯交换反应 Scheme 7 Lipase@NP biocomposite catalyzed transesterification |
金属有机框架材料(MOFs)能够在均相体系中参与反应, 且具有较高的选择性和活性而受到广泛关注.在这几类多孔材料中, 其具有较多数量的催化位点以及大小可调的孔径, 很大程度上提高了固定化酶的效率.组成MOFs的有机配体大多以极性较强的官能团为主, 例如羰基、羧基、醛基、碳-碳双键、氨基等基团, 这与组成酶的氨基酸中的肽键有相似的结构, 能够有效的固定化酶.另外, 其稳定的结构能够在强酸、强碱环境中保护酶的活性; 同时, 较小的密度和较高的疏水性能够有效打开脂肪酶的“盖子”, 使活性中心暴露, 增强催化活性.此外, 不论是共价键合、表面附着、孔道包封和共沉淀[50]几种固定化方式都能适用于MOFs.
2016年, Cao课题组[56]首次报道了将枯草芽孢杆菌脂肪酶(BSL2)固定化在Cu-BTC的层级多孔金属有机骨架材料中的研究.固定化的BSL2在酯化反应过程中具有很高的酶促活性和重复使用性.在10个循环后, 固定化的BSL2仍显示出其初始酶活性的90.7%和其初始转化的99.6%.这是在有机溶剂中脂肪酶固定在MOFs材料上的首次报道(Scheme 8).
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图式 8 BSL2@Cu-BTC生物复合材料催化酯化反应 Scheme 8 BSL2@Cu-BTC biocomposite catalyzed esterification |
2017年, Liu课题组[57]报道了一种由金属有机骨架衍生的纳米孔碳(NPC)材料, 其中最主要的材料是cMIl 100(Al)(经羧基修饰后在不同温度下热解的NPC), 并成功用于固定化洋葱伯克霍尔德氏菌脂肪酶.该介孔NPC修饰的氧化铝提高了酶的负载率和大豆油酯交换反应的催化性能, 为绿色且可持续的工业应用技术提供了新的方向(Scheme 9).
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图式 9 BCL@cMIL 100(Al)生物复合材料催化酯交换反应 Scheme 9 BCL@cMIL 100 (Al) biocomposite catalyzed transesterification |
2019年, Samui课题组[58]报道了通过吸附法一步将假丝酵母脂肪酶固定在Zn-(NH2-BDC)金属有机骨架(MOFs)上的研究, 固定化结束后, 观察到假丝酵母脂肪酶在Zn-(NH2-BDC)MOF上的负载量为280 mg/g, 酶载量效果较为理想.固定化后的酶用于催化对硝基苯基丁酸酯的水解反应, 显示出优异的稳定性和催化活性.最重要的是, 固定化后的假丝酵母脂肪酶在重复使用10次后仍保留其初始活性的79%(Scheme 10).
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图式 10 CRL@Zn-(NH2-BDC)生物复合材料催化酯水解反应 Scheme 10 CRL@Zn- (NH2-BDC) biocomposite catalyzed ester hydrolysis |
2020年, Li课题组[59]报道了将嗜热脂肪酶(QLM)成功地固定化在生物基金属有机骨架(MOF)上的研究.该MOF通过仿生矿化的方法将乙酸锌与腺嘌呤进行反应从而合成该金属有机框架材料, 以对硝基苯基辛酸酯的水解为模型反应, 利用该QLM@MOF在高温、碱性条件以及金属离子存在下进行反应, 结果显示出较高的催化活性和稳定性.最后, 固定化酶成功地应用于生物柴油的制备, 转化率>60%, 且具有优异的可回收性, 在使用3个循环后未观察到晶体结构和形态的变化(Scheme 11).
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图式 11 QLM@MOF生物复合材料催化酯交换反应 Scheme 11 QLM@MOF biocomposite catalyzed transesterification |
共价有机框架材料(COFs)具有大范围的网状结构、较大的比表面积值(可达4000 m2/g)、较高的热稳定性(400~500 ℃)以及很多开放位点, 这为形成大量稳定的固定化酶提供了最佳的平台.与MOFs相比, 使用COFs固定化酶的优势是通过使用特定的构建块能更精确地控制其化学结构, 由于其难溶于水, 与绝大多数有机溶剂不反应, 将酶固定化在其表面后, 显著提高了其在水介质和有机溶剂中的稳定性[60].在固定化酶时, 对酶具有较好亲和力的交联剂能够利用COFs构建块的多功能性对酶进行修饰, 进而提高了与特定酶的亲和力, 并可以设计出与特定酶亲和力更高的框架, 也为开发新的酶固定化策略提供了新的方向.
2017年, Sun课题组[60]首次报道了将脂肪酶(PS)固定化在COF上的研究, 该COF具有独特的介孔结构和可调节的表面化学性质.结果表明, 该COF对酶具有很高的亲和力和负载效率, 与其他类型的多孔材料相比, 该COF能很好地保持酶的活性并表现出数量级的催化活性, 且易回收(Scheme 12).
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图式 12 PS@COF生物复合材料催化酯交换反应 Scheme 12 PS@COF biocomposite catalyzed transesterification |
2019年, Oliveira课题组[61]通过一个亚胺连接的共价有机框架材料, 采用3种固定化酶方法将南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)固定到该共价有机框架上, 包括表面物理吸附、表面官能团的共价固定和合成后添加的连接体的共价固定.将该固定化酶用于油酸和乙醇的酯化反应中, 发现该固定化材料负载的CALB具有较高的比活性, 在58~283 U/mg之间, 是游离酶的2.6~12.7倍.实验表明, 该材料是一种对酶合适的固定化载体, 可以显著提高酶活性, 增强热稳定性, 并使生物催化剂能够再循环使用(Scheme 13).
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图式 13 CALB@PPF-2生物复合材料催化酯化反应 Scheme 13 CALB@PPF-2 biocomposite catalyzed esterification |
多孔有机共聚物具有质量较轻、比表面积较高, 以及有较多稳定的分子网络结构的优势, 也广泛应用于酶的固定化.
2018年, Silva课题组[62]成功合成了聚(苯乙烯-共-二乙烯基苯), 并通过聚合乳液磁化磁铁矿(STY-DVB-M)进行磁化, 从而形成用于脂肪酶固定化的磁珠.该磁珠具有较好的物理吸附和高固定化率(> 70%)和水解活性(大约1850 U/g), 并固定化了两种微生物脂肪酶(伯克霍尔德菌脂肪酶和荧光假单胞菌脂肪酶).研究表明, 两种固定化的脂肪酶都能够催化椰子油与乙醇的酯交换反应以产生脂肪酸乙酯(FAEE), 而且固定化酶循环使用7次后而仍保持其活性, 半衰期为970 h.
2019年, Weltz课题组[63]报道了将枯草芽孢杆菌脂肪酶A(LipA)固定化在聚(磺基甜菜碱甲基丙烯酸甲酯)(PSBMA)上的研究, 在最佳温度条件下, 酶活性得到了显著提高.催化性能的显著提高主要是由于LipA的结构稳定性以及使用单分子Foster共振能量转移测量LipA的构象动力学变化, 而且周转频率提高了100倍(Scheme 14).
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图式 14 LipA@PSBMA生物复合材料催化酯水解反应 Scheme 14 LipA@PSBMA biocomposite catalyzed ester hydrolysis |
同年, Li课题组[64]利用聚乙二醇(PEG)对聚乳酸(PLA)进行修饰形成生物相容性良好的PLA/PEG膜, 再利用1, 6-六亚甲基二胺和戊二醛作为交联剂, 将假丝酵母脂肪酶固定化在PLA/PEG膜上, 随后以异辛烷为溶剂用于催化橄榄油的水解反应.并用扫描电镜和傅里叶红外光谱对脂肪酶的固定化性能进行了表征.结果表明, 假丝酵母脂肪酶已成功固定在生物相容性PLA/PEG膜上.另外, 1, 6-六亚甲基二胺可以保持酶的最大活性.此外, 固定化酶的最佳温度从45变为50 ℃, 固定化脂肪酶的pH值从6.5变为7.5.热灭活实验表明, 固定化的脂肪酶在50 ℃的缓冲液中处理120 min后, 保留的原始活性高达63%, 显著高于对照组.与游离脂肪酶保持其初始活性的23%相比, 固定化脂肪酶在储存30 d后可以成功保留高达70%的活性.最后, 固定化酶在经过6个循环后仍具有82%的活性.
2020年, Cejudosanches等[65]报道了通过吸附将根瘤菌根霉脂肪酶(RML)固定化在辛基琼脂糖上的研究, 并进一步用聚烯丙基胺(PAA)涂覆在RML上, 研究结果发现, PAA层仅能发挥约4倍的稳定作用, 而与醛-葡聚糖的进一步交联则大大提高了其稳定作用.与固定化的可溶性酶相比, 在55 ℃和pH 7下, 新衍生物固定化RML的稳定性比未涂覆的固定化RML高440倍以上, 并且催化活性高出7倍(Scheme 15).
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图式 15 Lipase@RML-PAA生物复合材料催化酯水解反应 Scheme 15 Lipase@RML-PAA biocomposite catalyzed ester hydrolysis |
碳多孔材料具有较高的孔隙率, 吸附能力, 以及对酸和碱较佳的耐受性, 使得它对于酶的固定化也非常有价值[66-68].碳多孔材料具有较高的比表面积, 这为负载更多质量的酶提供了条件.碳多孔材料上含有羟基和羧基、内酯和酚基, 它们允许离子相互作用, 而且易于与交联剂形成稳定的共价键, 能够有效的防止固定化酶的流失, 这为共价固定化酶提供先决条件[69].碳的疏水性促进了对脂肪酶的快速吸附, 从而产生界面活化现象[70-72].即当脂肪酶达到脂/水界面时, 界面活化的特征是活性迅速增加.脂肪酶会被吸附到疏水界面上, 从而导致酶内部结构的变化, 使α-螺旋盖打开, 活性中心暴露在底物上.
2006年, Dong等[73]报道了一种预处理过的米根霉脂肪酶被固定化在硅胶表面的新方法.固定化前, 先用0.1%大豆油预处理米根霉脂肪酶, 以防止在共价固定过程中失去其活性.结果表明, 大豆油预处理过的固定化脂肪酶比用其他材料预处理的固定化脂肪酶具有更好的活性, 为630 U/g, 是固定化非预处理脂肪酶活性的20倍.另外, 该预处理的固定化脂肪酶活性在重复使用10次后仍保持在其原始活性的90%以上.
2018年, Reichardt课题组[74]以多孔混凝土(PCM-1)和硅胶(PCM-2和PCM-3)作为固定化载体, 将绵羊热霉菌脂肪酶(TLL)通过N-(3-二甲氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)分别共价固定化在3种多孔碳材料上, 得到了重复性较好、稳定性较佳、活性较高的固定化产物, 然后用于催化对硝基苯基棕榈酸酯(pNPP)的水解反应; 结果表明, 共价结合的TLL-PCM保持了100%的初始活性, 还具有12个月长的储存期.这为脂肪酶的固定化提供了一种新的载体(Scheme 16).
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图式 16 TLL-PCM生物复合材料催化酯交换反应 Scheme 16 TLL-PCM biocomposite catalyzed transesterification |
碳纳米管具有较小的传质阻力, 导致不论从外部还是内部都能对酶进行固定化, 进而显著提高酶的负载量, 而且其内部可以采用包覆的方式对酶进行固定化, 有效的保护和防止酶的流失.同时, 其较为理想的孔隙率碳结构能够大幅度提高酶与底物的接触面积.此外, 最吸引人的是对于在碳纳米管外不能发生的反应都能在内部发生, 为反应提供了一个稳定的容器.
2011年, Tan课题组[75]报道了通过浸渍方法将磁性氧化铁纳米颗粒负载到多壁碳纳米管(MWNTs)上的研究.在将解脂耶氏酵母脂肪酶共价固定化在该磁性纳米管上后, 利用磁性多壁碳纳米管-脂肪酶拆分庚烷溶剂中的(R, S)-1-苯基乙醇, 与天然脂肪酶相比, 该固定化脂肪酶在庚烷中拆分(R, S)-1-苯基乙醇中具有较高的酶活性, 且易回收.此外, 发现在超声处理该固定化脂肪酶长达30 min后, 磁性多壁碳纳米管-脂肪酶的催化作用几乎不受影响, 而天然脂肪酶的催化活性随超声处理时间的延长而降低(Scheme 17).
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图式 17 Lipase@M-MWNT生物复合材料催化酯化反应 Scheme 17 Lipase@M-MWNT biocomposite catalyzed esterification |
2016年, Cao课题组[76]报道了将血浆修饰的多壁碳纳米管用作固定脂肪酶载体的研究; 结果表明, 在最佳条件下, 血浆修饰的多壁碳纳米管固定化脂肪酶时吸附量可达0.15 g/g, 固定化脂肪酶的最大酶活性为520 U/g.此外, 在聚乙二醇(PEG)-脂肪族酯的合成中, MWNTs-脂肪酶产生的酯化率约为47%.
2019年, Socka课题组[77]将南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)通过非共价固定化在多壁碳纳米管上, 并在基于纳米生物催化剂和1, 5-戊二醇的新型催化/引发体系下, 利用CALB-CNT制备ε-己内酯(CL)和碳酸三亚甲基酯(TMC)的无金属(共)聚合物.通过核磁共振碳谱研究它们的微观结构, 同时通过差示扫描热量法研究其热性能.研究表明CALB-CNT复合材料催化剂在连续5个循环中均未显示出明显的活性损失.无毒催化剂在制备聚合物中的研究对工业和生物医学应用具有重要意义, 碳纳米管固定化脂肪酶的出现解决了这一重大难题(Scheme 18).
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图式 18 CALB@MWCNT生物复合材料催化聚合反应 Scheme 18 CALB@MWCNT biocomposite catalyzed polymerization |
分子筛具有很多可用于固定化脂肪酶的优势, 有清晰、高度有序的孔道分布和极高的内表面积(可高达600 g/m2), 孔径单一, 孔径大小的可调控范围较宽, 这不仅能够有选择性的对特定大小的酶进行有效的固定化, 防止固定化过程中酶的流失, 还能提高负载量.分子筛的主要成分是硅酸盐, 在PBS缓冲溶液中固定化酶时对酶的吸附性能较佳, 反应过程中, 能够减少极性溶剂对酶的解吸附作用, 防止酶的流失.
2002年, Pires课题组[78]报道了利用MCM-41和Al-MCM-41分子筛固定化几种脂肪酶的研究, 并用于乙酸与乙醇的气相酯化反应.研究结果表明, 酯化反应中截留在MCM-41和Al-MCM-41孔中的酶的活性顺序为OF(根瘤菌脂肪酶) < FAP-15(米根霉脂肪酶) < LEX(爪哇毛霉菌脂肪酶) < PS(假单胞菌洋葱脂肪酶) < AK(荧光假单胞菌脂肪酶), 而且在25和45 ℃之间进行的实验表明该固定化脂肪酶的活性不受温度影响, 这表明酶被有选择性地固定在分子筛孔中, 能够有效避免失活或自溶等问题(Scheme 19).
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图式 19 Lipases@MCM生物复合材料催化气相酯化反应 Scheme 19 Lipases@MCM biocomposite catalyzed gas-phase esterification |
2010年, Raghuvanshi等[79]报道了以戊二醛作为交联剂, 用分子筛固定化脂肪酶的研究, 在55 ℃条件下反应2 h后, 酶活力只损失了12%, 同时催化对4-硝基苯基棕榈酸酯(4-NPP)的水解反应, 在8个循环后仍能保持85%的酶活力.与游离酶相比, 该固定化酶在pH 7.5~9.0范围内稳定, 用有机溶剂洗涤后没有变性, 很大程度上提高了酶的稳定性(Scheme 20).
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图式 20 Lipase@Zeolites生物复合材料催化酯交换反应 Scheme 20 Lipase@Zeolites biocomposite catalyzed transesterification |
二氧化硅固定化酶的方法主要是先通过伯胺对其表面进行修饰, 再通过戊二醛两端的醛基分别于该氨基和酶中氨基进行共价连接, 进而达到固定化酶的目的.具有无化学反应性[80]和吸附性能良好的优点, 还可以采用吸附方式固定化酶.
2013年, Zhang课题组[81]报道了将猪胰腺脂肪酶(PPL)共价固定化在多孔二氧化硅颗粒(PSP)表面上的研究, 该颗粒被不同表面活性基团修饰过, 在每克载体上可以获得86.2~158.2 mg的天然PPL偶联收率.此外, 在更高的温度下, 该固定化PPL(IPPL)能够在离子液体介质中成功催化聚己内酯(PCL)和聚(5, 5-二甲基-1, 3-二恶烷-2-酮)(PDTC)的合成反应, 而且具有长期高温稳定性, 有助于固定化和离子液体效果的良好结合.然而, 天然PPL不能用于合成任何聚合物, 这表明IPPL具有比天然PPL较高的催化活性.还显示了在离子液体介质中的IPPL对聚合反应的催化活性与固定化酶和环状单体的性质都有十分密切的关系(Scheme 21).
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图式 21 IPPL生物复合材料催化聚合反应 Scheme 21 IPPL biocomposite catalyzed polymerization |
2018年, Zhang课题组[82]利用吸附法将猪胰脂肪酶(PLL)固定在纳米SiO2上, 然后在最佳pH 7.6和温度40~50 ℃条件下催化橄榄油的水解反应.在固定化脂肪酶重复催化反应8次后, 还具有初始活性的73.5%, 而游离脂肪酶活性在2 d内损失了50%;这证明了固定化酶在连续多次循环利用后, 仍保持有较高的活性, 提高了酶的稳定性.
4.3 多孔陶瓷材料多孔陶瓷材料的固定化原理跟二氧化硅一样, 多孔陶瓷的主要成分也含有硅酸盐, 且具有较大孔径, 能够较好的吸附酶, 其较高的开口气孔率能够为酶的固定化提供较多进入路径, 进而提高固定化酶的量.同时, 在强酸、强碱和有机介质中也有较好的稳定性, 能够保护酶失活和防止被污染.此外, 多次使用后, 再用气体或者液体洗涤, 依旧能够恢复其原来的过滤性能和清洁性, 这无疑有利于回收利用.
2000年, Masanobu等[83]报道了将脂肪酶(PS)固定化在多孔陶瓷载体(TN-M)上的研究, 该陶瓷材料以高岭石矿物为原料, 采用水热法制备.与其他工业固体载体相比, TN-M载体对脂肪酶的固定化具有较高的稳定性和选择性, PS@TN-M对有机底物的催化活性均高于游离粗酶, 还能从粗酶中选择性地富集脂肪酶蛋白(Scheme 22).
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图式 22 PS@TN-M生物复合材料催化酯交换反应 Scheme 22 PS@TN-M biocomposite catalyzed transesterification |
2005年, Ruckenstein等[84]报道了使用多孔陶瓷固定化脂肪酶(PS-CⅡ)的研究, 并用于催化乙酸乙烯酯在丙酮中低温拆分5-羟甲基-3-苯基-2-异恶唑啉(±)-1的反应.结果表明, 与游离PS-CⅡ的对映体选择性相比较低(E=5.9), 而较固定化PS-CⅡ的对映体选择性得到显著提高, 最高可达249(60 ℃), 进一步扩大了低温方法的应用范围.此外, 这是第一例报道的脂肪酶催化拆分异恶唑啉衍生物(±)-1, 具有实际可行性和较高的对映选择性(Scheme 23).
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图式 23 PS-CⅡ生物复合材料催化酯交换反应 Scheme 23 PS-CⅡ biocomposite catalyzed transesterification |
2015年, Gao课题组[85]通过戊二醛将假丝酵母脂肪酶固定化在多孔陶瓷块Man-8上, 并作为甘露醇和脂肪酸乙烯基酯制备油凝剂的催化剂, 还对固定化脂肪酶的活性和稳定性进行了研究.结果表明, 与天然脂肪酶相比, 固定化脂肪酶的稳定性明显提高.此外, 在固定化脂肪酶的催化下, 经过48 h的反应, 该油胶凝剂的产率可达78%以上; 第5次循环利用后, 收率仍可保持在50%以上.该研究不仅为制备稳定的脂肪酶生物催化剂提供了一种方法, 而且还为油胶凝剂的工业化生产提供了新的途径(Scheme 24).
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图式 24 Lipase@Man生物复合材料催化酯交换反应 Scheme 24 Lipase@Man biocomposite catalyzed transesterification |
大孔树脂是一类吸附性能良好的有机高分子聚合物材料.大孔树脂由三维立体孔结构组成, 孔径和比表面积较大, 热稳定性较高, 在水溶液和非水溶液中都能利用, 这更有利于酶活性的提高.最重要的是其优良的吸附性能和筛选原理能够选择性地固定吸附能力和分子量大小不同的物质, 固定化效果极佳, 并通过洗脱剂洗涤而达到分离目的.此外, 由于较高的孔隙率, 能够可调控的固定化脂肪酶[86].
2011年, Wang课题组[87]报道了将假丝酵母脂肪酶通过京尼平交联固定化到两种中孔树脂中的研究.在最佳条件下, 当京尼平浓度为0.5%时, 在树脂NKA-9上固定化的脂肪酶的活性回收率可达到96.99%, 对于含量为0.2%的S-8则可达到86.18%.与使用戊二醛作为交联剂相比较, 使用京尼平交联固定化的脂肪酶具有较高的pH和热稳定性, 储存稳定性和可重复使用性.此外, 在6个水解循环后, 使用京尼平作为交联剂的固定化脂肪酶的残留活性保持其初始活性的60%以上, 而使用戊二醛作为交联剂则仅保留约35%的活性.
2013年, Li课题组[88]报道了利用一种固定化效果较好的大孔树脂(MPR-NKA)固定化脂肪酶(BCL)的研究.以1-苯基乙醇与乙酸乙烯酯的外消旋酯交换反应作为模型反应, 进行催化.与游离酶相比, 固定化BCL的酶活性和对映体选择性(ee)得到了显著的提高, 在10到65 ℃范围内显示出较理想的热稳定性和较高的催化效率.在连续使用30多个批次后, 固定化脂肪酶仍保持其大部分活性.与其他固定化脂肪酶相比, 固定化BCL还具有更好的催化效率(Scheme 25).
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图式 25 BCL@MPR-NKA生物复合材料催化酯交换反应 Scheme 25 BCL@MPR-NKA biocomposite catalyzed transesterification |
2019年, Feng课题组[89]将黑曲霉脂肪酶(ANL)固定化在6种不同的大孔丙烯酸树脂上, 并把6种不同的ANL-丙烯酸树脂复合材料用于催化高酸酱油的渣油(SSR), 脱酸生成二酰基甘油.树脂MARE具有较低孔隙率, 较高堆积密度和中等疏水性的优点, 且由于具有最佳热稳定性和可重复使用性, 因而被选为脂肪酶的最佳固定化载体, 与固定化的南极洲念珠菌脂肪酶(Novozym435)相比, ANL-MARE生物复合材料不仅具有较高的脱酸活性和良好的热稳定性, 而且可以连续重复使用15个循环, 仍有良好的活性, 还提高了酶的温度范围.
5.2 多孔壳聚糖材料壳聚糖是一类比较受关注的固定化材料, 它具有较好的生物降解性、生物相容性和生物效应.另外, 壳聚糖的C2位分别被氨基和乙酰胺取代, 还有羟基, 从而具有较好的化学修饰、活化、偶联性能, 这为在共价交联中有效固定化酶和提高酶活性提供了基础, 也因此具有较好的吸附性、吸湿性和保湿性, 溶解后易形成凝胶.此外, 壳聚糖在有机溶剂中稳定性较强, 能够在有机溶剂中很好的保护酶.
2011年, Palla课题组[90]报道了将根瘤菌脂肪酶(RM)固定化在不同的改性壳聚糖微球上的研究, 并用于催化向日葵油与棕榈酸、硬脂酸中游离的脂肪酸之间的酸解反应.研究结果表明, 改性的壳聚糖颗粒比未改性的壳聚糖颗粒更大, 疏水性更高.活性最高的壳聚糖固定化RM使棕榈酸和硬脂酸的组成发生了变化, 从原油中的9.6%值变化到最终结构化脂质中的49.1%值, 超过了几乎3倍的酶活化效果.在重复使用7个周期(总共168 h)后仍旧保持了较高的转化率.结果表明, 经修饰后的壳聚糖对于吸附和过度活化RM是有效的.
2019年, Pinheiro课题组[91]找到一种交联性能比戊二醛更好的物质-二乙烯基砜(DVS)), 并作为固定化酶的交联剂[92-93], 将南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)固定化在壳聚糖上.随后, 研究了固定化酶在pH 5.0、7.0和10.0的稳定性, 发现在pH 10.0时催化性能最佳.最后, 利用该脂肪酶-壳聚糖复合材料对已酸乙酯的水解进行生物催化, 并在pH 5.0下表现出14 520.37 U/g固定化脂肪酶的活性.这些结果表明, 使用二乙烯基砜活化的壳聚糖对脂肪酶进行固定化是具有不错的前景, 并且所提出的方案能够成功提高酶的稳定性(Scheme 26).
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图式 26 CALB@Chitosan-DVS生物复合材料催化酯水解反应 Scheme 26 CALB@Chitosan-DVS biocomposite catalyzed ester hydrolysis |
同年, Pinheiro课题组[94]报道了一种新型的固定化酶载体, 即壳聚糖-二乙烯基砜(DVS).在pH值分别为10.0、12.5和14.0下用DVS激活壳聚糖, 并将壳聚糖-二乙烯基砜作为南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)的固定化载体.研究发现, 在用pH 10.0使用DVS活化壳聚糖过程时, 可获得最高的热稳定性.与戊二醛作为载体活化剂时相比, 固定化效果更好.随后将壳聚糖-二乙烯基砜固定化的CALB用于己酸乙酯的水解, 并在pH 5.0下表现出14 520.37 U/g固定化脂肪酶的活性.这些结果表明, 用二乙烯基砜活化的壳聚糖是酶固定化良好载体, 能够较好提高脂肪酶的稳定性(Scheme 27).
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图式 27 CALB@Chitosan-DVS生物复合材料催化酯水解反应 Scheme 27 CALB@Chitosan-DVS biocomposite catalyzed ester hydrolysis |
我们主要从多孔材料所具有的比表面积和孔隙率较高, 稳定性较佳, 吸附性能良好等优势来阐述了其在固定化脂肪酶领域的应用, 多孔材料能够有效地解决固定化酶中存在的易失活、难回收利用、催化活性低以及成本高昂等问题.同时还通过举例说明纳米多孔材料、大配体多孔材料、碳骨架多孔材料、氧化硅骨架多孔材料和聚合物多孔材料等在固定化脂肪酶方面的应用, 表明了多孔材料对固定化脂肪酶的良好效果.但从现实情况和固定化酶的长远发展来看, 仍然有很多挑战.一方面, 大多数固定化酶的载体主要研究的是脂肪酶, 而对蛋白酶类、氧化还原酶类、转移酶类、裂合酶类和合成酶类的报道相对较少; 而且对酶结构信息的研究也不深入、不完善.另一方面, 很多固定化酶的材料合成成本和条件相对较高, 比如MOFs和COFs材料, 这是科研工作者无法避免的现实问题.不过随着科研人员综合素质的不断提高和各种基础研究设施的完善以及方法条件的改进, 均可为以上问题的解决提供一定的条件支撑.此外, 随着研究的深入, 合成生物杂化催化剂以及酶与其他催化剂的协同催化反应具有较高的研究价值和发展前景, 这为生物催化的发展提供了更多的可能, 进而也能更好地为医药、工业生产、纺织和材料制造业等服务.
| [1] |
Fitzpatrick D, Ley S V. Engineering chemistry for the future of chemical synthesis[J]. Tetrahedron, 2017, 74(25): 3087–3100.
|
| [2] |
Cherie , Turner . Review of chemistry of sustainable energy[J]. J Chem Edu, 2015, 92(4): 601–602.
|
| [3] |
Caruso T, De Vries F T, Bardgett R D, et al. Soil organic carbon dynamics matching ecological equilibrium theory[J]. Ecology Evolution, 2018, 8(22): 11169–11178.
|
| [4] |
Maccoss M, Baillie T A. Organic chemistry in drug discovery[J]. Science, 2018, 303(5665): 1810–1813.
|
| [5] |
Gates B C. Concluding remarks:Progress toward the design of solid catalysts[J]. Faraday Discuss, 2016, 188: 591–602.
DOI:10.1039/C6FD00134C |
| [6] |
Veluru Ramesh Naidu, Shengjun Ni, Johan Franzen. The carbocation:A forgotten lewis acid catalyst[J]. Chemcatchem, 2015, 7(13): 1896–1905.
DOI:10.1002/cctc.201500225 |
| [7] |
Bajus S, Agel F, Kusche M, et al. Alkali hydroxide-modified Ru/γ-Al2O3 catalysts for ammonia decomposition[J]. Appl Catal Gen, 2015, 510(2016): 189–195.
|
| [8] |
Takeuchi D. Recent progress in olefin polymerization catalyzed by transition metal complexes:New catalysts and new reactions[J]. Dalton Trans, 2009, 39(2): 311–328.
|
| [9] |
Wang Z, Wang H F, Hu P. Possibility of designing catalysts beyond the traditional volcano curve:A theoretical framework for multi-phase surfaces[J]. Chem Sci, 2015, 6(10): 5703–5711.
|
| [10] |
Madhavan A, Sindhu R, Binod P, et al. Strategies for design of improved biocatalysts for industrial applications[J]. Biore Technol, 2017, 245: 1304–1313.
DOI:10.1016/j.biortech.2017.05.031 |
| [11] |
Yushkova E D, Nazarova E A, Matyuhina A V, et al. Application of immobilized enzymes in food industry[J]. J Agr Food Chem, 2019, 67(42): 11553–11567.
DOI:10.1021/acs.jafc.9b04385 |
| [12] |
Shakya , Akhilesh , Kumar , et al. An update on smart biocatalysts for industrial and biomedical applications[J]. Biore Technol, 2018, 245(15): 1304–1313.
|
| [13] |
Fang Z, Yong Y C, Zhang J, et al. Keratinolytic protease:A green biocatalyst for leather industry[J]. Appl Micro & Biotechnol, 2017, 101(21): 7771–7779.
|
| [14] |
Yeom S J, Kim M, Kwon K K, et al. A synthetic microbial biosensor for high-throughput screening of lactam biocatalysts[J]. Nat Commun, 2018, 9(1): 5053.
|
| [15] |
Fan X, Niehus X, Sandoval G. Lipases as biocatalyst for biodiesel production[J]. Methods Mol Biol, 2012, 861: 471–483.
|
| [16] |
Choi J, Han S, Kim H. Industrial applications of enzyme biocatalysis:Current status and future aspects[J]. Biotechnol Adv, 2015, 33(7): 1443–1454.
|
| [17] |
Meyer H, Eichhorn E, Hanlon S P, et al. The use of enzymes in organic synthesis and the life sciences:Perspectives from the Swiss Industrial Biocatalysis Consortium (SIBC)[J]. Catal Sci & Technol, 2013, 3(1): 29–40.
|
| [18] |
Casas-Godoy L, Gasteazoro F, Duquesne S, et al. Lipases:An overview[J]. Methods Mol Biol, 2018, 1835: 3–38.
|
| [19] |
Lv L, Dai L, Du W, et al. Effect of water on lipase NS81006-catalyzed alcoholysis for biodiesel production[J]. Process Biochem, 2017, 58: 239–244.
DOI:10.1016/j.procbio.2017.04.033 |
| [20] |
Patel N, Rai D, Shivam , et al. Lipases:Sources, production, purification, and applications[J]. Recent Pat Biotechnol, 2019, 13(1): 45–56.
|
| [21] |
Azerad R. ChemInform abstract:Application of biocatalysts in organic synthesis[J]. Cheminform, 2010, 26(31): 17–51.
|
| [22] |
Lee H Y, Kimura S, Iwata T. Lipase-catalyzed regioselective synthesis of dextrin esters[J]. Biomacromolecules, 2019, 20(2): 705–711.
DOI:10.1021/acs.biomac.8b01374 |
| [23] |
Chiplunkar P P, Zhao X, Tomke P D, et al. Ultrasound-assisted lipase catalyzed hydrolysis of aspirin methyl ester[J]. Ultrasonics Sonochemistry, 2017, 40: 587–593.
|
| [24] |
Jahangiri A, Moller A, Danielsen M, et al. Hydrophilization of bixin by lipase-catalyzed transesterification with sorbitol[J]. Food Chem, 2018, 268: 203–209.
DOI:10.1016/j.foodchem.2018.06.085 |
| [25] |
Qin J, Zou X, Lv S, et al. Influence of ionic liquids on lipase activity and stability in alcoholysis reactions[J]. RSC Adv, 2016, 6(90): 87703–87709.
DOI:10.1039/C6RA19181A |
| [26] |
Chen J, Li Z Y. Lipase catlyzed synthesis of epoxy-fatty acids[J]. Chin J Chem, 2000, 18(2): 247–248.
|
| [27] |
Nelson J M. Adsorption of invertase[J]. J Am Chem Soc, 1916, 38(5): 1109–1115.
DOI:10.1021/ja02262a018 |
| [28] |
Barton T J, Bull L M, Klemperer W G, et al. Tailored porous materials[J]. Chem Mater, 1999, 11(10): 2633–2656.
DOI:10.1021/cm9805929 |
| [29] |
Pascanu V, Miera G G, Inge A K, et al. Metal-organic frameworks as catalysts for organic synthesis:A critical perspective[J]. J Am Chem Soc, 2019, 141(18): 7223–7234.
DOI:10.1021/jacs.9b00733 |
| [30] |
Yuan G, Jiang H, Zhang L, et al. Metallosalen-based crystalline porous materials:Synthesis and property[J]. Coordination Chemistry Reviews, 2017, 378: 483–499.
|
| [31] |
Shao P J, Chen H, Ying Q, et al. Structure-activity relationship of carbonic anhydrase enzyme immobilized on various silica-based mesoporous molecular sieves for CO2 absorption into a potassium carbonate solution[J]. Energy & Fuels, 2020, 34(2): 2089–2096.
|
| [32] |
Shun-Ichi M, Manami C, Tatsuo T, et al. Enzyme immobilization in mesoporous silica for enhancement of thermostability[J]. J Nanosci & Nanotechnol, 2018, 18(1): 104–109.
|
| [33] |
Bommarius , Andreas S. Stabilizing biocatalysts[J]. Chem Soc Rev, 2013, 42(15): 6534–6565.
DOI:10.1039/c3cs60137d |
| [34] |
Mileti N, Nastasovi A, Loos K. Immobilization of biocatalysts for enzymatic polymerizations:Possibilities, advantages, applications[J]. Bioresource Technol, 2012, 115(11): 126–135.
|
| [35] |
Sulman E M, Matveeva V G, Bronstein L M. Design of biocatalysts for efficient catalytic processes[J]. Curr Opin Chem Eng, 2019, 26: 1–8.
DOI:10.1016/j.coche.2019.06.005 |
| [36] |
Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Anal Biochem, 1976, 72(12): 248–254.
|
| [37] |
Chen Z, Liu L, Yang R. Improved performance of immobilized lipase by interfacial activation on Fe3O4@PVBC nanoparticles[J]. RSC Adv, 2017, 7(56): 35169–35174.
DOI:10.1039/C7RA05723G |
| [38] |
Lyu J, Li Z, Men J, et al. Covalent immobilization of Bacillus subtilis lipase A on Fe3O4 nanoparticles by aldehyde tag:An ideal immobilization with minimal chemical modification[J]. Process Biochem, 2019, 81: 63–69.
DOI:10.1016/j.procbio.2019.03.017 |
| [39] |
Mosayebi M, Salehi Z, Doosthosseini H, et al. Amine, thiol, and octyl functionalization of GO-Fe3O4 nanocomposites to enhance immobilization of lipase for transesterification[J]. Renew Energy, 2020, 154: 569–580.
DOI:10.1016/j.renene.2020.03.040 |
| [40] |
Butt A, Farrukh A, Ghaffar A, et al. Design of enzyme-immobilized polymer brush-grafted magnetic nanoparticles for efficient nematicidal activity[J]. RSC Adv, 2015, 5(95): 77682–77688.
DOI:10.1039/C5RA10063A |
| [41] |
Duarte Neto J M W, Maciel J D C, Campos J F, et al. Optimization of penicillium aurantiogriseum protease immobilization on magnetic nanoparticles for antioxidant peptides' obtainment[J]. Prep Biochem Biotechnol, 2017, 47(7): 644–654.
DOI:10.1080/10826068.2017.1292286 |
| [42] |
Hou C, Wang Y, Ding Q, et al. Facile synthesis of enzyme-embedded magnetic metal-organic frameworks as a reusable mimic multi-enzyme system:Mimetic peroxidase properties and colorimetric sensor[J]. Nanoscale, 2015, 7(44): 18770–18779.
DOI:10.1039/C5NR04994F |
| [43] |
Pashangeh K, Akhond M, Karbalaeiheidari H R, et al. Biochemical characterization and stability assessment of Rhizopus oryzae lipase covalently immobilized on amino-functionalized magnetic nanoparticles[J]. Int J Biol Macromol, 2017, 105: 300–307.
DOI:10.1016/j.ijbiomac.2017.07.035 |
| [44] |
Patel S K, Choi S H, Kang Y C, et al. Eco-friendly composite of Fe3O4-reduced graphene oxide particles for efficient enzyme immobilization[J]. ACS Appl Mater Interfaces, 2017, 9(3): 2213–2222.
DOI:10.1021/acsami.6b05165 |
| [45] |
Zisis T, Freddolino P L, Turunen P, et al. Interfacial activation of Candida antarctica lipase B:Combined evidence from experiment and simulation[J]. Biochem,, 2015, 54(38): 5969–5979.
DOI:10.1021/acs.biochem.5b00586 |
| [46] |
Du Y, Gao J, Kong W, et al. Enzymatic synthesis of glycerol carbonate using a lipase immobilized on magnetic organosilica nanoflowers as a catalyst[J]. ACS Omega, 2018, 3(6): 6642–6650.
DOI:10.1021/acsomega.8b00746 |
| [47] |
Ren W, Fei X, Tian J, et al. Multiscale immobilized lipase for rapid separation and continuous catalysis[J]. New J Chem,, 2018, 42(16): 13471–13478.
DOI:10.1039/C8NJ01950A |
| [48] |
Ren W, Li Y, Wang J, et al. Synthesis of magnetic nanoflower immobilized lipase and its continuous catalytic application[J]. New J Chem, 2019, 43(28): 11082–11090.
DOI:10.1039/C8NJ06429F |
| [49] |
Ding Y, Erlebacher J. Nanoporous metals with controlled multimodal pore size distribution[J]. J Am Chem Soc, 2003, 125(26): 7772–7773.
DOI:10.1021/ja035318g |
| [50] |
Doonan C J, Ricco R, Liang K, et al. Metal-organic frameworks at the biointerface:Synthetic strategies and applications[J]. Accounts Chem Res, 2017, 50(6): 1423–1432.
DOI:10.1021/acs.accounts.7b00090 |
| [51] |
Qiu Hua-jun, Xu Cai-xia, Huang Xi-rong, et al. Adsorption of laccase on the surface of nanoporous gold and the direct electron transfer between them[J]. The Journal of Physical Chemistry C, 2008, 112(38): 14781–14785.
DOI:10.1021/jp805600k |
| [52] |
Qiu H, Xue L, Ji G, et al. Enzyme-modified nanoporous gold-based electrochemical biosensors[J]. Biosens Bioelectron, 2009, 24(10): 3014–3018.
DOI:10.1016/j.bios.2009.03.011 |
| [53] |
Racheli R, Emir H, Adi S. Nanoporous metallic networks:Fabrication, optical properties, and applications[J]. Adv Mater, 2018, 30(41): e1706755.
DOI:10.1002/adma.201706755 |
| [54] |
Du X, Liu X, Li Y, et al. Efficient biocatalyst by encapsulating lipase into nanoporous gold[J]. Nanoscale Research Letters, 2013, 8(1): 180.
DOI:10.1186/1556-276X-8-180 |
| [55] |
Chronopoulou L, Scaramuzzo F A, Fioravanti R, et al. Noble metal nanoparticle-based networks as a new platform for lipase immobilization[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2020, 146: 790–797.
DOI:10.1016/j.ijbiomac.2019.10.047 |
| [56] |
Cao Y, Wu Z, Wang T, et al. Immobilization of bacillus subtilis lipase on a Cu-BTC based hierarchically porous metal-organic framework material:A biocatalyst for esterification[J]. Dalton Transactions, 2016, 45(16): 6998–7003.
DOI:10.1039/C6DT00677A |
| [57] |
Liu L H, Shih Y H, Liu W L, et al. Enzyme immobilized on nanoporous carbon derived from metal-organic framework:A new support for biodiesel synthesis[J]. ChemSusChem, 2017, 10(7): 1364–1369.
DOI:10.1002/cssc.201700142 |
| [58] |
Samui A, Chowdhuri A R, Sahu S K. Lipase immobilized metal-organic frameworks as remarkably biocatalyst for ester hydrolysis:A one step approach for lipase immobilization[J]. Chem Select, 2019, 4(13): 3745–3751.
|
| [59] |
Li Q, Chen Y X, Bai S W, et al. Immobilized lipase in bio-based metal-organic frameworks constructed by biomimetic mineralization:A sustainable biocatalyst for biodiesel synthesis[J]. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces, 2020, 188: 7.
|
| [60] |
Sun Q, Fu C W, Aguila B, et al. Pore environment control and enhanced performance of enzymes infiltrated in covalent organic frameworks[J]. J Am Chem Soc, 2018, 140(3): 984–992.
DOI:10.1021/jacs.7b10642 |
| [61] |
Oliveira F L, Souza S P, Bassut J, et al. Enzyme-decorated covalent organic frameworks as nanoporous platforms for heterogeneous biocatalysis[J]. Chemistry-A European Journal, 2019, 25(69): 15863–15870.
DOI:10.1002/chem.201903807 |
| [62] |
Silva M V C, Aguiar L G, de Castro H F, et al. Optimization of the parameters that affect the synthesis of magnetic copolymer styrene-divinilbezene to be used as efficient matrix for immobilizing lipases[J]. World J Microbiol Biotechnol, 2018, 34(11): 169.
DOI:10.1007/s11274-018-2553-1 |
| [63] |
Weltz J S, Kienle D F, Schwartz D K, et al. Dramatic increase in catalytic performance of immobilized lipases by their stabilization on polymer brush supports[J]. ACS Catal, 2019, 9(6): 4992–5001.
DOI:10.1021/acscatal.9b01176 |
| [64] |
Li S, Zhao S, Hou Y, et al. Polylactic acid (PLA) modified by polyethylene glycol (PEG) for the immobilization of lipase[J]. Appl Biochem Biotechnol, 2019, 190(3): 982–996.
|
| [65] |
Cejudosanches J, Orrego A H, Jaimemendoza A, et al. High stabilization of immobilized rhizomucor miehei lipase by additional coating with hydrophilic crosslinked polymers:Poly-allylamine/aldehyde-dextran[J]. Process Biochem, 2020, 92: 156–163.
DOI:10.1016/j.procbio.2020.02.026 |
| [66] |
Luangon B, Siyasukh A, Winayanuwattikun P, et al. Flow-through immobilization of candida rugosa lipase on hierarchical micro-/macroporous carbon monolith[J]. J Mol Catal:Enzymatic, 2012, 75: 80–85.
DOI:10.1016/j.molcatb.2011.11.017 |
| [67] |
Olaf K, Nina D, Matti D, et al. Synthesis of porous carbon monoliths using hard templates[J]. Materials, 2016, 9(3): 214.
DOI:10.3390/ma9030214 |
| [68] |
Stoica L. Enhanced direct electron transfer between laccase and hierarchical carbon microfibers/carbon nanotubes composite electrodes[J]. Electrochimica Acta, 2012, 82(12): 218–223.
|
| [69] |
Bedin K C, Martins A C, Cazetta A L, et al. KOH-activated carbon prepared from sucrose spherical carbon:Adsorption equilibrium, kinetic and thermodynamic studies for Methylene Blue removal[J]. Chem Eng J, 2016, 286: 476–484.
DOI:10.1016/j.cej.2015.10.099 |
| [70] |
Bernal C, Illanes A, Wilson L. Heterofunctional hydrophilic-hydrophobic porous silica as support for multipoint covalent immobilization of lipases:Application to lactulose palmitate synthesis[J]. Langmuir, 2014, 30(12): 3557–3566.
DOI:10.1021/la4047512 |
| [71] |
Manoel E A, Santos J C S D, Freire D M G, et al. Immobilization of lipases on hydrophobic supports involves the open form of the enzyme[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2015, 71: 53–57.
DOI:10.1016/j.enzmictec.2015.02.001 |
| [72] |
Mathesh M, Luan B, Akanbi T O, et al. Opening lids:Modulation of lipase immobilization by graphene oxides[J]. ACS Catal, 2016, 6(7): 4760–4768.
DOI:10.1021/acscatal.6b00942 |
| [73] |
Dong H L, Kim J M, Shin H Y, et al. Optimization of lipase pretreatment prior to lipase immobilization to prevent loss of activity[J]. J Micro & Biotechnol, 2007, 17(4): 650–654.
|
| [74] |
Reichardt C, Utgenannt S, Stahmann K P, et al. Highly stable adsorptive and covalent immobilization of thermomyces lanuginosus lipase on tailor-made porous carbon material[J]. Biochem Eng J, 2018, 138: 63–73.
DOI:10.1016/j.bej.2018.07.003 |
| [75] |
Tan H, Feng W, Ji P. Lipase immobilized on magnetic multi-walled carbon nanotubes[J]. Bioresource Technology, 2012, 115: 172–176.
DOI:10.1016/j.biortech.2011.10.066 |
| [76] |
Cao X, Zhang R, Tan W M, et al. Plasma treatment of multi-walled carbon nanotubes for lipase immobilization[J]. Korean Journal of Chemical Engineering, 2016, 33(5): 1653–1658.
DOI:10.1007/s11814-016-0002-0 |
| [77] |
Socka M, Sitko M, Boncel S, et al. Nanobiocatalyst from lipase non-covalently immobilized on multiwalled carbon nanotubes for copolymerization of ε-caprolactone and trimethylene carbonate[J]. Polymer Degradation and Stability, 2019, 170: 1–9.
|
| [78] |
Pires E L, Miranda E A, Valenca G P. Gas-phase enzymatic esterification on immobilized lipases in MCM-41 molecular sieves[J]. Appl Biochem Biotechnol, 2002, 98(1): 963–976.
|
| [79] |
Raghuvanshi S, Gupta R. Advantages of the immobilization of lipase on porous supports over free enzyme[J]. Protein Pept Lett, 2010, 17(11): 1412–1416.
DOI:10.2174/0929866511009011412 |
| [80] |
Wang Z, Yang X, Yang J, et al. Peroxidase-like activity of mesoporous silica encapsulated Pt nanoparticle and its application in colorimetric immunoassay[J]. Analytica Chimica Acta, 2015, 862: 53–63.
DOI:10.1016/j.aca.2014.12.046 |
| [81] |
Zhang Z, He F, Zhuo R. Immobilized lipase on porous silica particles:Preparation and application for biodegradable polymer syntheses in ionic liquid at higher temperature[J]. Journal of Molecular Catalysis B-enzymatic, 2013, 94: 129–135.
DOI:10.1016/j.molcatb.2013.05.013 |
| [82] |
Zhang Q, Qian J, Guo H, et al. Utilization of nano-SiO2 as a supporting material for immobilization of porcine pancreatic lipase[J]. J Nanosci Nanotechnol, 2018, 18(8): 5837–5841.
DOI:10.1166/jnn.2018.15366 |
| [83] |
Kamori M, Hori T, Yamashita Y, et al. Immobilization of lipase on a new inorganic ceramics support, toyonite, and the reactivity and enantioselectivity of the immobilized lipase[J]. Journal of Molecular Catalysis B Enzymatic, 2000, 9: 269–274.
DOI:10.1016/S1381-1177(99)00105-8 |
| [84] |
Ruckenstein E, Wang X. Lipase immobilized on hydrophobic porous polymer supports prepared by concentrated emulsion polymerization and their activity in the hydrolysis of triacylglycerides[J]. Biotechnol Bioeng, 1993, 42(7): 821–828.
DOI:10.1002/bit.260420706 |
| [85] |
Gao J, Feng K, Li H W, et al. Immobilized lipase on porous ceramic monoliths for the production of sugar-derived oil gelling agent[J]. RSC Adv, 2015, 5(84): 68601–68609.
DOI:10.1039/C5RA10570F |
| [86] |
Li X, Li D, Wang W, et al. Immobilization of SMG1-F278N lipase onto a novel epoxy resin:Characterization and its application in synthesis of partial glycerides[J]. Journal of Molecular Catalysis B-enzymatic, 2016, 133: 154–160.
DOI:10.1016/j.molcatb.2016.08.011 |
| [87] |
Wang W, Jiang Y, Zhou L, et al. Comparison of the properties of lipase immobilized onto mesoporous resins by different methods[J]. Appl Biochem & Biotechnol, 2011, 164(5): 561–572.
|
| [88] |
Li X, Huang S, Xu L, et al. Improving activity and enantioselectivity of lipase via immobilization on macroporous resin for resolution of racemic 1-phenylethanol in non-aqueous medium[J]. Bmc Biotechnol, 2013, 13(1): 92.
|
| [89] |
Feng K, Huang Z, Peng B, et al. Immobilization of aspergillus niger lipase onto a novel macroporous acrylic resin:Stable and recyclable biocatalysis for deacidification of high-acid soy sauce residue oil[J]. Bioresource Technology, 2020, 298: 1–37.
|
| [90] |
Palla C A, Pacheco C, Carrin M E. Preparation and modification of chitosan particles for rhizomucor miehei lipase immobilization[J]. Biochem Eng J, 2011, 55(3): 199–207.
|
| [91] |
Pinheiro B B, Rios N S, Rodríguez Aguado E, et al. Chitosan activated with divinyl sulfone:A new heterofunctional support for enzyme immobilization. Application in the immobilization of lipase B from Candida antarctica[J]. Int J Biol Macromol, 2019, 130: 798–809.
|
| [92] |
Dos Santos J C S, Rueda N, Barbosa O, et al. Characterization of supports activated with divinyl sulfone as a tool to immobilize and stabilize enzymes via multipoint covalent attachment. Application to chymotrypsin[J]. RSC Adv, 2015, 5(27): 20639–20649.
|
| [93] |
Santos J C S D, Rueda N, Barbosa O, et al. Bovine trypsin immobilization on agarose activated with divinylsulfone:Improved activity and stability via multipoint covalent attachment[J]. Journal of Molecular Catalysis B-enzymatic, 2015, 117: 38–44.
|
| [94] |
Pinheiro B B, Rios N S, Aguado E R, et al. Chitosan activated with divinyl sulfone:A new heterofunctional support for enzyme immobilization.Application in the immobilization of lipase B from Candida antarctica[J]. Int J Biol Macromol, 2019, 130: 798–809.
|