2024, Vol. 38
在多种脂肪酸中, 羟基脂肪酸(HFAs)构成了一个独特的类别. 其中5-羟基十四烷酸是一种重要的化工中间体, 光学纯5-羟基十四烷酸是不对称合成反应中重要的配体合成子, 在制药、精细化工、食品等领域应用广泛[1]. 研究发现, 5位羟基硬脂酸异构体对各种肿瘤细胞系具有生长抑制作用[2−3]. 其手性原料六元环状酯, 即δ-十四内酯, 亦是重要的生物活性分子和食品添加剂中香味的主要来源[4−5].
光学纯的化合物可以通过化学拆分或化学不对称合成来制备[6]. 然而, 化学不对称合成在实践中的应用可能会受到必要手性试剂、高成本催化剂和低光学纯度产物的阻碍; 此外, 含有重金属的化学催化剂会严重影响产品的质量[7−8]. 基于绿色化学的概念, 生物催化剂越来越多地被现代合成化学家使用[9]. 酶动力学拆分具有立体选择性高、反应条件温和、环境友好等优点, 可以弥补化学拆分的不足, 是一种前景广阔的适合大规模生产的绿色合成方法[10−12].
脂肪酶在有机溶剂中具有高催化活性和热稳定性, 因此被广泛应用于合成手性化合物[13]. 我们通过筛选出合适的脂肪酶选择性水解δ-十四内酯得到具有良好立体选择的5-羟基十四烷酸. 先通过单因素实验分析, 选择响应面(RSM)分析的自变量为助溶剂比例、温度、酶酯比和反应时间; 再通过中心复合设计(CCD)[14]响应面分析法确定了最佳反应参数, 获得了具有高收率、高光学活性的光学纯5-羟基十四烷酸和光学纯δ-十四内酯.
1 实验部分 1.1 主要试剂δ-十四内酯(CAS No.
取12只5 mL EP管, 加入20 mg外消旋δ-十四内酯作为底物, 加入1 mL 磷酸缓冲液作为溶剂, 分别依次加入5 mg 12种脂肪酶作为催化剂. 在30 ℃下, 120 r·min−1摇床中反应8 h. 产物后处理及衍生化处理后进入HPLC检测分析.
1.3 脂肪酶催化内酯水解反应脂肪酶催化水解反应流程图如图1所示[15]. 取30 mg外消旋δ-十四内酯, 加入1 mL磷酸缓冲液作为溶剂, 再加入适量脂肪酶和适量助溶剂于5 mL反应烧瓶中, 5 ℃下反应20 h. 反应结束后, 向其中加入1 mL乙酸乙酯、适量2,4′-二溴苯乙酮和3滴三乙胺, 40 ℃下过夜反应, 反应结束后加入1 mL水和3滴5%的盐酸洗涤两次, 取上清液25 μL, 使用高效液相色谱(HPLC)进行分析.
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图 1 酶动力学拆分方案 Fig.1 Enzyme kinetic resolution scheme |
动力学拆分效率通过酶催化水解反应产物的光学纯度(eep)、产物收率(Y)和对映体选择率(E)进行评估, 使用以下公式计算[16−18]:
| $ ee_{{\mathrm{p}}1} = \frac{{S}_{3}-{S}_{4}}{{S}_{3}+{S}_{4}} , ee_{{\mathrm{p}}2} = \frac{{S}_{4}-{S}_{3}}{{S}_{3}+{S}_{4}} $ | (1) |
| $ \mathit{\mathrm{\mathit{Y}}}=\frac{S_3+S_4}{S_1+S_2} $ | (2) |
| $ \mathrm{\mathit{E}}=\frac{\mathrm{l}\mathrm{n}[1-Y\left(1+ee_{\mathrm{p}}\right)]}{\mathrm{l}\mathrm{n}[1-Y\left(1-ee_{\mathrm{p}}\right)]} $ | (3) |
用式(1), (2), (3)计算产物的光学纯度(eep)、产物收率(Y)和对映体选择率(E), 其中S1和S2代表消旋体衍生物的(S)和(R)对映体峰面积, S3和S4代表反应后产物的(S)和(R)对映体峰面积.
1.4 分析方法我们采用高效液相色谱(HPLC)对5-羟基十四烷酸进行定性、定量分析. 由于δ-十四内酯经酶拆分后得到的手性5-羟基十四烷酸无紫外吸收与荧光发射, 故将5-羟基十四烷酸经柱前衍生后再经HPLC对其检测. 衍生剂选用2,4′-二溴苯乙酮, 衍生方法如图2, 利用该方法可以即时监测和有效评估酶法拆分的对映体手性纯度[19]. 色谱柱为CHIRALCEL OD-H(4.6 mm×250 mm×5 µm); 流动相配比为异丙醇/正己烷(7∶93, 体积比); 流速为1.3 mL·min−1; 检测波长为254 nm; 柱温为36 ℃; 进样量为20 μL.
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图 2 5-羟基十四烷酸的衍生化方法 Fig.2 Derivatization method of 5-hydroxytetradecanoic acid |
脂肪酶、pH、温度、助溶剂、酶用量、底物摩尔比和反应时间是影响拆分性能的重要因素, 我们通过单因素实验研究了这些因素的影响. 在单因素实验结果的基础上, 采用响应面法对工艺开展了进一步的综合优化. 以Y和eep为指标, 采用中心组合设计考查一些重要定量因素的影响. 采用二次多项式模型对中心组合设计中得到的数据进行拟合. 在Design Expert软件(版本13.0)上进行优化.
最佳pH: 实验共分为2组. 第1组: 取4只5 mL EP管, 加入20 mg δ-十四内酯, 各取1 mL pH为6.0、7.0、8.0和9.0的磷酸缓冲液作为溶剂, 加入5 mg ANL作为催化剂. 在30 ℃下, 120 r·min−1摇床中反应8 h. 第2组: 替换为5 mg PCL作为催化剂, 重复上述步骤.
最佳温度: 实验共分为2组. 第1组: 取7只5 mL EP管, 加入20 mg δ-十四内酯及1 mL磷酸缓冲液, 各加入5 mg ANL作为催化剂. 温度设置为6、12、18、24、30、36和42 ℃. 120 r·min−1摇床中反应8 h. 第2组: 替换为5 mg PCL作为催化剂, 重复上述步骤.
最佳助溶剂: 实验共分为2组. 第1组: 取12只5 mL EP管, 加入δ-十四内酯及1 mL磷酸缓冲液, 分别加入有机溶剂20%(体积分数): 正庚烷、正己烷、环己烷、甲苯、异丙醚、甲基叔丁基醚、四氢呋喃、1,4-二氧六环、二甲基亚砜、乙酸乙酯、N,N-二甲基甲酰胺; 对照组, 加入5 mg ANL作为催化剂. 温度设置为36 ℃, 120 r·min−1摇床中反应8 h. 第2组: 替换为5 mg PCL作为催化剂, 温度设置为12 ℃, 重复上述步骤.
最佳酶酯比: 实验共分为2组. 第1组: 取4只5 mL EP管, 加入20 mg δ-十四内酯及1 mL磷酸缓冲液, 加入20% 1,4-二氧六环(体积分数), 依次向反应体系中加入2.5 mg(1∶8)、3.3 mg(1∶6)、5 mg(1∶4)、10 mg(1∶2)和20 mg(1∶1)的ANL并摇匀. 温度设置为36 ℃, 120 r·min−1摇床中反应8 h. 第2组: 替换为PCL作为催化剂, 替换为20%正己烷(体积分数)作为助溶剂, 温度设置为12 ℃, 重复上述步骤.
最佳反应时间: 实验共分为2组. 第1组: 取6只5 mL EP管, 加入20 mg δ-十四内酯、1 mL磷酸缓冲液及20% 1,4-二氧六环(体积分数), 依次向反应体系中加10 mg(1∶2)的ANL并摇匀. 温度设置为36 ℃, 120 r·min−1摇床中反应, 反应时间依次为3、6、9、12、18和24 h. 第2组: 替换为3.3 mg (1∶6)的PCL作为催化剂, 替换为20%正己烷(体积分数)作为助溶剂, 温度设置为12 ℃, 重复上述步骤.
2 结果与讨论 2.1 脂肪酶的筛选为了选择最合适的脂肪酶, 测试了实验室酶库中不同的12种市售脂肪酶(ANL、PCL、Lipase G、Lipase RM RM、Lipase PPL、Lipase TL LM、Lipase M、Lipase CY YG、Lipase CRL、Novozym 435、Lipase PL LM与Lipase OPE). 脂肪酶的活性和立体选择性如图3所示. 研究发现, 不同脂肪酶在产物收率(Y)和反应产物的光学纯度(eep)方面存在显著差异. 其中, ANL具有最佳的对映选择性, eep1达到80.2%, E=11.7; PCL具有最高的催化活性, Y值为38.1%, E=11.0. 因此, 将ANL及PCL选为进一步研究的脂肪酶.
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图 3 不同脂肪酶的拆分效率 Fig.3 Resolution efficiency of different lipases |
酶是含有氨基酸表面正负电离的聚电解质, pH可以改变细胞表面的电荷密度和酶的分子结构, 从而影响酶的解离状态, 进而影响酶的催化活性和立体选择性[20]. 如图4(a)所示, 对于1号酶ANL, pH为7时, eep1达到85.4%, Y1达到25.0%. 对于2号酶PCL, pH为8时, eep2达到78.9%, Y2达到37.5%. 在过酸或过碱性环境下均不利于酶的生存, 活性降低. 因此, 选择pH=7应用于ANL催化水解的反应体系, 选择pH=8应用于PCL催化水解的反应体系, 并用于后续实验.
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图 4 pH (a) 和温度 (b)对ANL和PCL酶促动力学拆分的影响 Fig.4 Effects of pH (a) and temperature (b) on the kinetic resolution of ANL and PCL |
温度可以影响酶的活性、选择性、稳定性以及反应平衡[21]. 控制在酶拆分过程中的温度范围为6~42 ℃, 结果如图4(b)所示. 对于1号酶ANL, 当温度从6 升高到36 ℃时, eep1呈增加趋势, 并在36 ℃时达到最大值86.2%, 同时Y1达到31.2%. 然而, 随着温度的进一步升高, eep1显著下降, 这是由于过高温度可能会影响酶蛋白的构象, 从而降低酶的对映选择性. 对于2号酶PCL, 低温有利于产生高eep2产物, 随着温度的升高, eep2呈下降趋势, 这可能是由于内酯底物自身水解导致, 但低温会导致转化率较低. 因此, 选择36 ℃作为ANL的反应体系温度, 选择12 ℃作为PCL的反应体系温度, 并用于后续实验.
2.2.2 助溶剂对酶促动力学拆分的影响酶的两相催化在酶工程中占有重要地位, 有机溶剂对酶的催化活性和稳定性有很大影响. 有研究表明, 在酶催化反应过程中加入适当比例的助溶剂, 可以有效提升酶的稳定性, 同时也可相应地增加其专一性[22−23]. 为使两相酶催化反应顺利进行, 助溶剂需要满足两个条件: 1) 具有较高的疏水性(lgP); 2) 具有较好的底物溶解性[24]. Griengl等[25]解释到, 酶在疏水性弱(lgP值小)的溶剂中容易失活, 而疏水性越强(lgP值越高)的溶剂越有利于酶反应. 针对两种不同的脂肪酶, 我们研究了11种助溶剂对酶催化内酯水解反应的影响. 如图5所示, 对于1号酶ANL, 尽管以二甲基亚砜作助溶剂时eep1达到最大值88.5%, 但Y1仅为20.2%, 酶催化水解的效率过低. 另外, 对照组Y1达到35.1%, 但eep1并不理想, 仅为80.4%. 而当助溶剂为1,4-二氧六环时, eep1达到86.4%, 同时Y1达到33.2%. 因此综合考虑, 选择1,4-二氧六环作为ANL的反应体系的助溶剂. 对于2号酶PCL, 对照组Y2达到48.2%, 但eep2仅68.2%. 选择以高lgP有机溶剂正己烷作为助溶剂, eep2达到94.7%远高于其他组, 同时Y2达到42.2%. 因此选择正己烷作为PCL的反应体系的助溶剂(编号对应的助溶剂: 1号为正庚烷、2号为正己烷、3号为环己烷、4号为甲苯、5号为异丙醚、6号为甲基叔丁基醚、7号为四氢呋喃、8号为1,4-二氧六环、9号为二甲基亚砜、10号为二氯甲烷、11号为N,N-二甲基甲酰胺、12号为对照组).
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图 5 助溶剂对(a) ANL和(b) PCL酶促动力学拆分的影响 Fig.5 Effects of cosolvent on the kinetic resolution of (a) ANL and (b) PCL enzymes |
底物量和酶量都是影响酶反应的重要因素之一, 底物浓度过高, 可能造成底物抑制, 而酶量过高也会使酶的对应选择性降低, 同时对反应进程造成影响[26]. 因此, 适当的酶酯比不仅可以获得最佳的反应效果, 而且可以提高经济效益[27]. 如图6所示, 对于1号酶ANL, 随着酶酯比的增加, eep1和Y1都呈递增趋势, 在酶酯比大于1∶2 时, 增长速率趋于平稳, 这可能归因于一定量的酶的活性位点有限. 考虑到酶酯比越高, 经济效益越低, 因此选择酶酯比为1∶2, 此时eep1达到88.6%, Y1达到39.8%. 对于2号酶PCL, 在酶酯比为1∶6时, eep2达到最大值96.2%, Y2达到42.3%. 因此, 将ANL反应体系的酶酯比设定为1∶2, 将 PCL反应体系的酶酯比设定为1∶6.
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图 6 酶酯比对ANL和PCL酶促动力学拆分的影响 Fig.6 Effect of enzyme-ester ratio on the kinetic resolution of ANL and PCL |
考查了时间对脂肪酶催化水解反应的影响, 反应结果如图7所示. 对于1号酶ANL, 在反应开始时, 随着反应时间的延长, 收率迅速提高, 同时保持了优异的对应选择性. 然而, 在超过6 h后, Y1增加缓慢, 水解率(H1)逐渐上升, eep1显著下降. 因此, 选择在6 h时终止反应, 此时eep1为95.4%, Y1达到32.8%, H1为1.6%. 对于2号酶PCL, 低温反应条件时, 对映选择性优异, 并且水解率较低, 但收率增长较为缓慢. 因此, 选择在12 h后终止反应, 此时eep2为96.1%, Y2达到43.7%, H2为0.9%. 综合实验结果, ANL反应体系选择在 6 h时终止反应, PCL反应体系选择在 12 h时终止反应.
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图 7 反应时间对 (a) ANL 和(b) PCL酶促动力学拆分的影响 Fig.7 Effects of reaction time on the kinetic resolution of (a) ANL and (b) PCL enzymes |
单因素实验表明, 重要因素对分辨率的影响较大, 然而, 由于没有考虑多因素的相互作用, 通过上述实验无法确定优化的条件. 我们使用Design Expert软件上的中心组合设计方法对条件进行了进一步优化. 以ANL作为催化剂, 在PB(0.2 mol·L−1, pH 7.0)溶液中, 以体积分数20%的1,4-二氧六环为助溶剂的条件下, 选择另外3个显著单因素作为优化变量, 分别是温度(A)、酶/酯比(B)、反应时间(C), 并以转化率Y和光学纯度eep作为响应值, 如表1. 根据 Design Expert 软件设计17组 CCD实验, 实验方案及结果见表2.
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表 1 RSM中自变量的编码和实际值 Table 1 Coding and actual values of independent variables in RSM |
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表 2 实验条件和反应的实际值 Table 2 Experimental conditions and the actual value of the reaction |
对表1和表2中的数据进行多元回归拟合, 拟合得到了eep1和Y1的二次回归方程: 选择二次多项式模型来拟合这些数据. eep1(Y1)和Y1(Y2)的数学模型如下公式所示:
| $ \begin{split} \mathit{ ee} _{ \mathrm{p1}}=&97.08-10.325A+5.4875B-5.6375C-\\ &2.125AB - 1.775AC + 1.2BC - 19.015A^2 -\\ &6.84B^2+0.71C^2\\[-17pt] \end{split} $ | (4) |
| $ \begin{split} { Y}_{\mathrm{1}}\,=&\,36.04\,+\,4.0625A\,+\,2.525B\,+\,7.7125C\,-\\& \,3.3AB\,-\,\,0.575AC\,\,+\,3BC\,-\,1.9825A^2\,\,-\\& 2.8075B^{2} +2.9825C^{2}F\\[-3pt] \end{split} $ | (5) |
F值越大和P值越小越能代表相关系数的显著性. 表3和表4展示了模型拟合检验及方差分析的结果. eep1和Y1的F值分别为72.46和14.00, P <
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表 3 eep1模型方差分析 Table 3 eep1 model analysis of variance |
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表 4 Y1模型方差分析 Table 4 Analysis of variance of Y1 model |
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图 8 A和B两因素交互作用对eep1影响的响应面图 Fig.8 Response surface diagram of the interaction between A and B on eep1 |
参照ANL催化水解内酯的响应面优化设计, 根据PCL催化水解δ-十四内酯得到(R)-5-羟基十四烷酸的实验结果和回归方程各项的方差分析, 以响应值eep2为主要因素, Y2为次要因素, 由响应面分析法模拟出酶法拆分的最佳工艺条件: 反应温度为6 ℃; 反应时间为10.4 h; PCL与内酯的质量比为0.14, 此时的eep2达到 99.61%, 收率达49.5%.
2.4 验证实验为验证 RSM 模拟的最佳数据, 以CCD 预测的参数值为条件, 分别进行了实验验证. 以ANL作为催化剂, 在PB(0.2 mol·L−1, pH=7.0)溶液中, 以20% 1,4 二氧六环为助溶剂, 35 ℃下, 酶酯比=0.67, 反应6 h 得到(S)-5-羟基十四烷酸(eep1 ≥ 99.9%, Y1=42.0%). 以PCL作为催化剂, 在PB(0.2 mol·L−1, pH=8.0)溶液中, 以20%正己烷为助溶剂, 6 ℃下 酶酯比为0.14, 反应 12 h得到(R)-5-羟基十四烷酸(eep2 ≥ 99.9%, Y2=49.0%). 两组实验结果与模型的预期值(42.3%、49.5%)均非常吻合(误差在3%以内). 放大实验的结果与模型预测值的误差也在3%以内, 表明该模型适用于工业生产和优化. 图9为经脂肪酶ANL和PCL拆分后的5-羟基十四烷酸的高效液相色谱图.
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图 9 经ANL和PCL拆分后的(a) (S)-5-羟基十四烷酸和(b) (R)-5-羟基十四烷酸的高效液相色谱图 Fig.9 High performance liquid chromatograms of (a) (R)-5-hydroxytetradecanoic acid and (b) (S)-5-hydroxytetradecanoic acid separated by ANL and PCL |
我们建立了一种高效的脂肪酶催化δ-十四内酯水解成光学纯5-羟基十四烷酸的反应体系. 对一系列脂肪酶进行了筛选得到脂肪酶ANL和PCL. 研究了有机溶剂、pH、酶酯比、时间和温度对反应产物收率(Y)和光学纯度(eep)的影响. 采用响应面法评估了一些重要因素的影响并优化工艺. 优化后得到(S)-5-羟基十四烷酸(eep1≥ 99.9%, Y=42.0%)和(R)-5-羟基十四烷酸(eep2≥99.9%, Y=49.0%). 该研究为直接获得光学纯5-羟基十四烷酸和光学纯δ-十四内酯提供了一个实用方案, 具有操作简单、能耗低、催化剂易用、高选择性和分离效率高等优点. 这种酶催化的合成效率高, 立体选择性优异, 符合环保效益, 为工业制备各种用途的手性羟基酸和光学纯δ-内酯提供了一种很有前途的方法.
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